發(fā)布時(shí)間：2022-04-22 23:09

　　tRNA中存在著大量的轉(zhuǎn)錄后修飾,這些修飾是由四種基礎(chǔ)核苷Uridine、Cytidine、Guanosine和Adenosine衍化而來。它們的存在對tRNA的結(jié)構(gòu)和功能有很大的影響,其中堿基或核糖的甲基化是最常見的轉(zhuǎn)錄后修飾,甲基化大多是由甲基轉(zhuǎn)移酶（methyltransferase,或MTase）催化完成。甲基化修飾及相關(guān)甲基轉(zhuǎn)移酶的功能已經(jīng)在酵母和人類基因中得到了大量研究,但是在高等植物中相關(guān)的研究卻少之又少,因此我們在本文中通過遺傳學(xué)、植物生理學(xué)及蛋白體外生化等研究方法,試圖研究tRNA甲基化修飾對水稻生長發(fā)育及逆境耐受的影響。本論文主要闡述了水稻tRNA-Am核苷修飾基因OsTRM13的相關(guān)功能研究。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果:OsTRM13基因可以將酵母Am缺失突變體菌株中的Am修飾成功補(bǔ)回,且體外原核誘導(dǎo)的OsTRM13蛋白可以催化酵母tRNA^GlyGCC第四位堿基C/A形成Cm/Am修飾,證明OsTRM13與酵母TRM13有類似的利用tRNA底物合成Am甲基化核苷的功能;OsTRM13基因的超表達(dá)材料和RNAi材料的研究表明OsTRM13基因的表達(dá)... 

【文章頁數(shù)】：106 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表(Abbreviations)
1 綜述
    1.1 tRNA概述
        1.1.1 tRNA的結(jié)構(gòu)
        1.1.2 tRNA的功能
    1.2 tRNA上的修飾核苷
        1.2.1 tRNA核苷甲基化酶
        1.2.2 tRNA核苷甲基化修飾
        1.2.3 2’-O-甲基化修飾
    1.3 本研究的目的與意義
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)菌株載體
        2.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 主要實(shí)驗(yàn)試劑
    2.2 水稻種植
    2.3 CTAB法提取植物組織DNA
    2.4 試劑盒微量提取tRNA(OMEGA miRNA kit)
    2.5 LC-MS分析核苷修飾
        2.5.1 樣品準(zhǔn)備
        2.5.2 LC-MS體系
    2.6 目的基因的克隆和載體構(gòu)建
        2.6.1 引物設(shè)計(jì)
        2.6.2 PCR擴(kuò)增目的基因
        2.6.3 PCR產(chǎn)物回收
        2.6.4 PCR產(chǎn)物連pBLUE-T載體
        2.6.5 CaCl_2法制大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
        2.6.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(熱激法)
        2.6.7 陽性菌落的PCR鑒定
        2.6.8 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取
        2.6.9 質(zhì)粒DNA的測序和序列比對分析
        2.6.10 基因和表達(dá)載體酶切回收
        2.6.11 目的片段與表達(dá)載體連接
        2.6.12 CaCl_2法制農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
        2.6.13 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
    2.7 水稻轉(zhuǎn)基材料獲得:農(nóng)桿菌侵染植物愈傷組織的方法
        2.7.1 培養(yǎng)基中試劑母液配方
        2.7.2 愈傷誘導(dǎo)
        2.7.3 愈傷繼代
        2.7.4 愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)
        2.7.5 選擇培養(yǎng)
        2.7.6 分化培養(yǎng)
        2.7.7 生根培養(yǎng)
    2.8 tRNA體外甲基化酶活測定
        2.8.1 OsTRM13.GST原核表達(dá)載體
        2.8.2 目標(biāo)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        2.8.3 T7體外轉(zhuǎn)錄tRNA底物
        2.8.4 tRNA體外甲基化反應(yīng)
    2.9 OsTRM13pmt::GUS載體構(gòu)建及GUS組織染色
        2.9.1 OsTRM13pmt::GUS載體構(gòu)建
        2.9.2 GUS組織染色
    2.10 OsTRM13 CRSPR突變體植物互補(bǔ)載體構(gòu)建
    2.11 水稻花粉活力檢測(I_2-KI染色法)
    2.12 植物轉(zhuǎn)錄組測序
        2.12.1 實(shí)驗(yàn)流程
        2.12.2 轉(zhuǎn)錄組分析流程
3 結(jié)果與分析
    3.1 OsTRM13 基因CRISPR材料表型觀察
    3.2 OsTRM13 基因CRISPR材料花粉活性檢測
    3.3 OsTRM13 CRISPR材料核苷修飾檢測
    3.4 OsTRM13 蛋白體外誘導(dǎo)及水稻內(nèi)源底物的tRNA體外甲基化
    3.5 OsTRM13 CRISPR純合突變體材料與野生型的轉(zhuǎn)錄組比較分析
    3.6 OsTRM13基因的組織特異性表達(dá)分析
4 討論與展望
5 論文數(shù)據(jù)說明
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄 Ⅰ:常用試劑配方
    附錄 Ⅱ:OsTRM13 基因啟動(dòng)子序列
    附錄 Ⅲ:OsTRM13 蛋白及基因序列
    附錄 Ⅳ:實(shí)驗(yàn)中用到的引物序列
    附錄 Ⅴ:轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析GO富集結(jié)果和KEGG富集結(jié)果
    附錄 Ⅵ:攻讀碩士期間發(fā)表的論文
    附錄 Ⅶ:個(gè)人簡歷
致謝



本文編號：3646858