玉米（Zea mays L.）作為世界上分布最廣泛的作物之一,其用途廣泛,不僅可以作為人類口糧,還可以作為牲畜飼料及工業(yè)生產原料。由于居民飲食結構中肉類的比例逐漸上升,極大地促進了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,對飼料的需求逐年攀升。玉米還可用于工業(yè)原料,生產淀粉,氨基酸和乙醇等,這帶動了玉米種植面積和總產量的穩(wěn)步上升。然而在世界范圍內玉米需求仍在持續(xù)增長,但供給情況并不樂觀。因此積極展開玉米的分子遺傳學研究,為玉米遺傳育種工作提供材料和基因資源,就顯得十分必要和迫切。然而玉米的分子遺傳學研究離不開轉基因和大量的突變體材料。另外玉米的株型較大不適合大規(guī)模溫室生長,生長周期較長等特點限制了玉米基因功能研究的發(fā)展。二穗短柄草（Brachypodium distachyon L.）與大麥,小麥,玉米等禾本科作物親緣關系較近,它們都是單子葉植物,另外二穗短柄草的基因組小,生長周期短,生長條件也簡單及自花授粉等特點使其成為了研究禾本科單子葉植物的模式材料。為了更好地開展玉米功能基因組學研究,本文致力于建立高效,可重復的玉米遺傳轉化體系和Ac/Ds標簽突變體庫,創(chuàng)造大量突變體材料,為玉米基因的... 

【文章來源】：山東農業(yè)大學山東省

【文章頁數】：120 頁

【學位級別】：碩士

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中文摘要
Abstract
1 前言
    1.1 玉米簡介
    1.2 玉米遺傳轉化技術的發(fā)展
        1.2.1 原生體法
        1.2.2 基因槍法
        1.2.3 電擊法、碳化硅晶體法和氣溶膠注射法
        1.2.4 農桿菌法
    1.3 玉米轉座子
        1.3.1 玉米轉座子的發(fā)現(xiàn)
        1.3.2 轉座子的類型
            1.3.2.1 Ac/Ds轉座子系統(tǒng)
            1.3.2.2 Mu轉座子系統(tǒng)
            1.3.2.3 En/Spm轉座子系統(tǒng)
    1.4 玉米突變體的發(fā)展現(xiàn)狀
        1.4.1 理化誘變技術
        1.4.2 CRISPR/Cas9 基因編輯法
        1.4.3 插入誘變
            1.4.3.1 T-DNA插入法
            1.4.3.2 轉座子標簽法
    1.5 SOC1 基因調控植物開花的研究現(xiàn)狀
    1.6 本課題的目的和意義
2 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料及其生長條件
        2.1.2 質粒與菌株
        2.1.3 酶及生化試劑
        2.1.4 引物
    2.2 實驗方法
        2.2.1 玉米遺傳轉化相關表達載體的構建
            2.2.1.1 感受態(tài)的制備
            2.2.1.2 植物總RNA的提取
            2.2.1.3 cDNA反轉錄
            2.2.1.4 Pfu高保真酶PCR擴增
            2.2.1.5 膠回收
            2.2.1.6 TA克隆
            2.2.1.7 轉化大腸桿菌
            2.2.1.8 提取質粒
            2.2.1.9 將克隆的DNA目的片段連接到植物表達載體
            2.2.1.10 轉化大腸桿菌
            2.2.1.11 提取質粒(試劑盒法)
            2.2.1.12 農桿菌AGL1或EHA105 的轉化
        2.2.2 基因槍法轉化玉米
            2.2.2.1 誘導愈傷
            2.2.2.2 基因槍質粒制備
            2.2.2.3 基因槍微彈的制備
            2.2.2.4 基因槍設備
            2.2.2.5 基因槍轟擊玉米愈傷組織
            2.2.2.6 GFP陽性幼苗的再生
            2.2.2.7 GFP陽性植株的分子分析
            2.2.2.8 GFP陽性植株的F1 代分析
        2.2.3 農桿菌介導的玉米遺傳轉化
            2.2.3.1 農桿菌侵染液的準備
            2.2.3.2 幼胚的處理
            2.2.3.3 侵染與共培養(yǎng)處理
            2.2.3.4 恢復培養(yǎng)
            2.2.3.5 GFP陽性幼苗的再生
            2.2.3.6 GFP陽性植株的PCR和 RT-PCR分析
            2.2.3.7 Southern雜交
            2.2.3.8 GFP陽性植株的F1 代分析
        2.2.4 玉米Ac/Ds突變體庫的構建與分析
            2.2.4.1 轉基因系T0代Ac轉座酶基因的表達分析
            2.2.4.2 玉米DNA的提取(試劑盒法)
            2.2.4.3 T-DNA定位
            2.2.4.4 轉基因系T0代fDs的體細胞轉座分析
            2.2.4.5 fDs插入突變植株的鑒定與富集
            2.2.4.6 fDs新插入位置的定位分析
        2.2.5 二穗短柄草SOC1-like(BdSOC1-like)功能的初步分析
            2.2.5.1 序列比對及進化分析
            2.2.5.2 qRT-PCR分析
            2.2.5.3 BdSOC1-like超表達載體(BdSOC1-like-ox)的構建
            2.2.5.4 二穗短柄草的遺傳轉化
            2.2.5.5 PCR
            2.2.5.6 pXQD17 陽性后代的遺傳分析
            2.2.5.7 開花時間分析
            2.2.5.8 種子特點分析
        2.2.6 統(tǒng)計分析
3 結果與分析
    3.1 本研究相關表達載體的構建
    3.2 玉米遺傳轉化
        3.2.1 基因槍法轉化玉米
            3.2.1.1 GFP輔助篩選抗性愈傷和抗性芽及植株
            3.2.1.2 基因槍法介導的玉米轉化頻率
            3.2.1.3 GFP陽性植株的分子鑒定
            3.2.1.4 GFP陽性植株中GFP的拷貝數分析
            3.2.1.5 GFP陽性植株的F1 代分析
        3.2.2 農桿菌介導的玉米轉化
            3.2.2.1 兩種共培養(yǎng)法(DC和 MC)對玉米瞬時轉化效率的影響對比
            3.2.2.2 T0 GFP陽性幼苗的再生及初步分析
            3.2.2.3 兩種共培養(yǎng)法(DC和 MC)對玉米再生和穩(wěn)定轉化效率的影響
            3.2.2.4 GFP陽性植株的F1 分析
    3.3 玉米Ac/Ds突變體庫的構建與分析
        3.3.1 pXQD70 陽性植株的T0 分析
            3.3.1.1 Ac轉座酶基因的表達分析
            3.3.1.2 T0 體細胞fDs轉座分析
        3.3.2 pXQD70 陽性株系后代的篩選
        3.3.3 F1 fDs轉座印跡分析
        3.3.4 非連鎖轉座的大規(guī)模富集
        3.3.5 fDs插入位置在染色體上的分布
        3.3.6 突變體表型分析
    3.4 BdSOC1-like基因功能的初步分析
        3.4.1 BdSOC1-like基因的生物信息學分析及分子克隆
        3.4.2 BdSOC1-like的空間表達分析
        3.4.3 BdSOC1-like的表達并沒有晝夜節(jié)律性
        3.4.4 冷處理對BdSOC1-like mRNA水平的影響
        3.4.5 BdSOC1-like超表達(BdSOC1-like-ox)陽性株系T0 的分子分析
        3.4.6 BdSOC1-like-ox陽性株系T1 后代的分離分析
        3.4.7 BdSOC1-like超表達能促進植物的成花轉變
        3.4.8 超表達BdSOC1-like產生了多效性表型
4 討論
    4.1 在玉米的遺傳轉化中,GFP熒光是一種可靠的可視化標簽
    4.2 干濾紙共培養(yǎng)法能顯著提高玉米的轉化效率
    4.3 有效的玉米遺傳轉化系統(tǒng)仍然需要改善
    4.4 Ac/Ds系統(tǒng)的工作情況
    4.5 BdSOC1-like基因功能的初步研究
5 結論
參考文獻
致謝
攻讀學位期間發(fā)表論文情況



本文編號：3635191