自上個世紀七十年代以來,科學家們一直致力于探索基因組的編輯技術。隨著1996年的鋅指核酸酶（Zinc-Finger Nuclease,ZFN）和2009年的轉錄激活效應因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease,TALEN）相繼發(fā)現并作為基因編輯手段進行應用,在基因組和基因功能相關研究方面取得了許多重要發(fā)現和進展。而在2013年,成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9）技術的出現,開啟了基因組編輯技術研究新的階段。CRISPR/Cas9及其衍生物作為當今研究最火熱的編輯手段,其突變效率高,易于操作的特點使其目被廣泛用于應用于多個模式生物的基因功能研究和目標疾病治療中,為生命科學的發(fā)展帶來了革命性的變化。然而,目前對Cas9編輯結果的理解尚存在許多未解謎題。目前普遍認為CRISPR/Cas9編輯后,會在打靶位點產生隨機堿基插入或缺失（indel）,除人為引入... 

【文章來源】：西南大學重慶市211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數】：81 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR-Cas和基因組工程研究領域的時間軸[4]

妒墾?宦畚?2早期的基因組編輯方法都依賴于DNA序列的位點特異性識別，包括利用靶向DNA切割方法識別寡核苷酸的DNA堿基；利用寡核苷酸與化學裂解或交聯試劑偶聯對酵母和哺乳動物細胞的位點特異性染色體的修飾[5–7]；肽核酸(PNAs)和聚酰胺使染色體位點發(fā)生靶向的結合[8,9]等。雖然這些方法并沒有達到高效穩(wěn)定的編輯，但它們證明了多種化學物質在位點特異性基因組修飾中的效用，使得特定位點的DNA可被切割。隨后，基因編輯技術飛速發(fā)展，多種編輯方式陸續(xù)出現，包括ZFNs[10–12]、TALENs[13–15]和CRISPR/Cas9[16–18]（圖1.2）等。圖1.2可編程序列特異性基因組編輯核酸酶的比較[19]Fig1.2Comparisonofprogrammablesequence-specific1.1.1ZFN編輯技術概述重復鋅結合域最早在非洲爪蟾（Xenopuslaevis）卵母細胞的轉錄因子IIIA中發(fā)現并鑒定，研究人員確定了一個X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-4-His-X4的序列基序(其中X可以是任何氨基酸)，并被命名為鋅指結構域[20]。少數含有鋅指結構域的蛋白質被詳細研究并發(fā)現這些鋅指結構域存在于許多調節(jié)真核生物基因表達的蛋白質中，能夠與DNA結合并參與真核生物基因調控[21,22]。為了了解這些鋅指結構域在位點特異性識別中的作用，Pavletich和Pabo表達、純化并解析了鋅指結構域，并討論了鋅指結構與DNA的相互作用以及蛋白質與DNA識別的意義，考慮了使用鋅指結構域作為設計新的DNA結合蛋白基礎的前景[11]。通過兩個不同的鋅指蛋白與FokI核酸內切酶的切割域連接，創(chuàng)造出了新的位點特異性核酸內切酶。當兩種融合蛋白處于最佳活性條件下，可以以序列特異性的方式切割DNA[23]。因此，將鋅指結構域中的鋅指基序和FokI內切酶的模塊結構結合，使得創(chuàng)建可以在靶向位點附近切割DNA死亡“人造”核酸酶成為可能

第一章文獻綜述5胞無法對DNA損傷做出恰當的反應或修復，則會導致基因組不穩(wěn)定，進而可能提高癌癥的發(fā)病率。目前發(fā)現的細胞內源性修復途徑主要由單鏈斷裂修復（singlestrandbreakrepair,SSBR）和雙鏈斷裂修復（doublestrandbreakrepair,DSBR）兩種。1.2.1單鏈斷裂修復修復DNA損傷的遺傳缺陷涉及多種疾病，其中許多疾病的典型表現是神經功能障礙、遺傳不穩(wěn)定性和癌癥的增加。在細胞中出現的不同類型的DNA損傷中，單鏈斷裂(singlestrandbreak,SSB)是最常見的，由細胞內代謝物的直接攻擊和自發(fā)的DNA衰變造成，每個細胞每天發(fā)生著數以萬計的損傷[44]。圖1.3全局單鏈斷裂修復模型[44]Fig1.3Modelforglobalsingle-strandbreakrepairSSB是指DNA雙螺旋結構中的一條鏈出現不連續(xù)性，通常伴有單個核苷酸的缺失，或者在斷裂部位的5’、3’端受損（圖1.3）。SSBs最常見的來源之一是內源性活性氧(ROS)的氧化

【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術研究進展[J]. 李聰,曹文廣.  生物工程學報. 2015(11)
[2]DNA雙鏈斷裂與NHEJ修復的研究進展[J]. 董雋,張?zhí)?文碧秀.  中華放射腫瘤學雜志. 2014 (06)
[3]類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）介導的基因組定點修飾技術[J]. 沈延,肖安,黃鵬,王唯曄,朱作言,張博.  遺傳. 2013(04)
[4]NHEJ途徑修復DSB的研究進展[J]. 孟榮榮,應明真,王雅杰.  醫(yī)學研究雜志. 2013(01)



本文編號：3620937