自上個(gè)世紀(jì)七十年代以來,科學(xué)家們一直致力于探索基因組的編輯技術(shù)。隨著1996年的鋅指核酸酶（Zinc-Finger Nuclease,ZFN）和2009年的轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nuclease,TALEN）相繼發(fā)現(xiàn)并作為基因編輯手段進(jìn)行應(yīng)用,在基因組和基因功能相關(guān)研究方面取得了許多重要發(fā)現(xiàn)和進(jìn)展。而在2013年,成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated 9,CRISPR/Cas9）技術(shù)的出現(xiàn),開啟了基因組編輯技術(shù)研究新的階段。CRISPR/Cas9及其衍生物作為當(dāng)今研究最火熱的編輯手段,其突變效率高,易于操作的特點(diǎn)使其目被廣泛用于應(yīng)用于多個(gè)模式生物的基因功能研究和目標(biāo)疾病治療中,為生命科學(xué)的發(fā)展帶來了革命性的變化。然而,目前對Cas9編輯結(jié)果的理解尚存在許多未解謎題。目前普遍認(rèn)為CRISPR/Cas9編輯后,會在打靶位點(diǎn)產(chǎn)生隨機(jī)堿基插入或缺失（indel）,除人為引入... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市211工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR-Cas和基因組工程研究領(lǐng)域的時(shí)間軸[4]

妒墾?宦畚?2早期的基因組編輯方法都依賴于DNA序列的位點(diǎn)特異性識別，包括利用靶向DNA切割方法識別寡核苷酸的DNA堿基；利用寡核苷酸與化學(xué)裂解或交聯(lián)試劑偶聯(lián)對酵母和哺乳動物細(xì)胞的位點(diǎn)特異性染色體的修飾[5–7]；肽核酸(PNAs)和聚酰胺使染色體位點(diǎn)發(fā)生靶向的結(jié)合[8,9]等。雖然這些方法并沒有達(dá)到高效穩(wěn)定的編輯，但它們證明了多種化學(xué)物質(zhì)在位點(diǎn)特異性基因組修飾中的效用，使得特定位點(diǎn)的DNA可被切割。隨后，基因編輯技術(shù)飛速發(fā)展，多種編輯方式陸續(xù)出現(xiàn)，包括ZFNs[10–12]、TALENs[13–15]和CRISPR/Cas9[16–18]（圖1.2）等。圖1.2可編程序列特異性基因組編輯核酸酶的比較[19]Fig1.2Comparisonofprogrammablesequence-specific1.1.1ZFN編輯技術(shù)概述重復(fù)鋅結(jié)合域最早在非洲爪蟾（Xenopuslaevis）卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子IIIA中發(fā)現(xiàn)并鑒定，研究人員確定了一個(gè)X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-4-His-X4的序列基序(其中X可以是任何氨基酸)，并被命名為鋅指結(jié)構(gòu)域[20]。少數(shù)含有鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)被詳細(xì)研究并發(fā)現(xiàn)這些鋅指結(jié)構(gòu)域存在于許多調(diào)節(jié)真核生物基因表達(dá)的蛋白質(zhì)中，能夠與DNA結(jié)合并參與真核生物基因調(diào)控[21,22]。為了了解這些鋅指結(jié)構(gòu)域在位點(diǎn)特異性識別中的作用，Pavletich和Pabo表達(dá)、純化并解析了鋅指結(jié)構(gòu)域，并討論了鋅指結(jié)構(gòu)與DNA的相互作用以及蛋白質(zhì)與DNA識別的意義，考慮了使用鋅指結(jié)構(gòu)域作為設(shè)計(jì)新的DNA結(jié)合蛋白基礎(chǔ)的前景[11]。通過兩個(gè)不同的鋅指蛋白與FokI核酸內(nèi)切酶的切割域連接，創(chuàng)造出了新的位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切酶。當(dāng)兩種融合蛋白處于最佳活性條件下，可以以序列特異性的方式切割DNA[23]。因此，將鋅指結(jié)構(gòu)域中的鋅指基序和FokI內(nèi)切酶的模塊結(jié)構(gòu)結(jié)合，使得創(chuàng)建可以在靶向位點(diǎn)附近切割DNA死亡“人造”核酸酶成為可能

第一章文獻(xiàn)綜述5胞無法對DNA損傷做出恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)或修復(fù)，則會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，進(jìn)而可能提高癌癥的發(fā)病率。目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)源性修復(fù)途徑主要由單鏈斷裂修復(fù)（singlestrandbreakrepair,SSBR）和雙鏈斷裂修復(fù)（doublestrandbreakrepair,DSBR）兩種。1.2.1單鏈斷裂修復(fù)修復(fù)DNA損傷的遺傳缺陷涉及多種疾病，其中許多疾病的典型表現(xiàn)是神經(jīng)功能障礙、遺傳不穩(wěn)定性和癌癥的增加。在細(xì)胞中出現(xiàn)的不同類型的DNA損傷中，單鏈斷裂(singlestrandbreak,SSB)是最常見的，由細(xì)胞內(nèi)代謝物的直接攻擊和自發(fā)的DNA衰變造成，每個(gè)細(xì)胞每天發(fā)生著數(shù)以萬計(jì)的損傷[44]。圖1.3全局單鏈斷裂修復(fù)模型[44]Fig1.3Modelforglobalsingle-strandbreakrepairSSB是指DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的一條鏈出現(xiàn)不連續(xù)性，通常伴有單個(gè)核苷酸的缺失，或者在斷裂部位的5’、3’端受損（圖1.3）。SSBs最常見的來源之一是內(nèi)源性活性氧(ROS)的氧化

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 李聰,曹文廣.  生物工程學(xué)報(bào). 2015(11)
[2]DNA雙鏈斷裂與NHEJ修復(fù)的研究進(jìn)展[J]. 董雋,張?zhí)?文碧秀.  中華放射腫瘤學(xué)雜志. 2014 (06)
[3]類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN）介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)修飾技術(shù)[J]. 沈延,肖安,黃鵬,王唯曄,朱作言,張博.  遺傳. 2013(04)
[4]NHEJ途徑修復(fù)DSB的研究進(jìn)展[J]. 孟榮榮,應(yīng)明真,王雅杰.  醫(yī)學(xué)研究雜志. 2013(01)



本文編號：3620937