[背景]芽胞桿菌源枯草桿菌蛋白酶（subtilisin carlsberg）、乙�；揪厶酋ッ福╝cetyl xylan esterase）和頭孢菌素乙酰水解酶（cephalosporin acetyl hydrolase）具有較高的過水解催化活性,有商業(yè)開發(fā)價值。[目的]挖掘芽胞桿菌菌株中具有過水解酶催化活性的水解酶蛋白基因,為后續(xù)制備過水解酶及酶法合成過氧乙酸奠定基礎(chǔ)。[方法]利用定向篩選培養(yǎng)基,從植物根際及納豆產(chǎn)品中篩選產(chǎn)蛋白酶芽胞桿菌候選菌株,并利用RFLP及16S rRNA基因?qū)ζ溥M行鑒定。從蛋白酶高產(chǎn)芽胞桿菌菌株中克隆枯草桿菌蛋白酶、乙酰木聚糖醋酶和頭孢菌素乙酰水解酶的全長基因。[結(jié)果]從植物根際土壤及納豆產(chǎn)品中共分離到85個候選菌株,RFLP及16S rRNA基因鑒定結(jié)果表明候選菌株均為芽胞桿菌,分別屬于Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus pumilus和Bacillus megaterium四個類群。從B.subtilis NSYT-3克隆的枯草桿菌蛋白酶基因編碼的多肽鏈全長381個氨基酸,從B.pumilus OSLJ... 

【文章來源】：微生物學(xué)通報. 2020,47(01)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

產(chǎn)蛋白酶菌株的16S rRNA基因序列的聚類分析

已有專利及文獻表明，B.subtilis產(chǎn)生的SCP、CAH蛋白及B.pumilus產(chǎn)生的AXE蛋白均具有較高的過水解催化酶活[11-12]，因此，本研究從分離到的B.subtilis NSYT-3菌株和B.pumilus OSLJ-13菌株中分別兊隆上述酶蛋白基因。從B.subtilis NSYT-3菌株兊隆的SCP蛋白的編碼基因全長1 146 bp(NCBI登錄號：MK673994)，編碼381個氨基酸，該肽鏈的氨基酸序列與已報道的B.licheniformis和B.lentus產(chǎn)生的SCP蛋白(PDB登錄號分別為：1AF4和1NDQ)的氨基酸序列的一致性(identity)分別為70%和60%。從B.subtilis NSYT-3菌株兊隆的CAH蛋白的編碼基因全長957 bp(NCBI登錄號：MK673996)，編碼318個氨基酸，該肽鏈的氨基酸序列與已報道的B.subtilis產(chǎn)生的CAH蛋白(PDB登錄號分別為：1ODS)其氨基酸序列具有高度的序列一致性，一致性達98%。從B.pumilus OSLJ-13菌株兊隆的AXE蛋白的編碼基因全長963 bp(NCBI登錄號：MK673995)，編碼320個氨基酸，該肽鏈的氨基酸序列與已報道的B.pumilus產(chǎn)生的AXE蛋白(PDB登錄號為2XLB)的氨基酸序列具有高度一致性，達97%。聚類分析結(jié)果顯示，本研究兊隆的3種酶蛋白與其他同功蛋白具有高度的序列一致性，分屬于SCP、CAH和AXE三類酶蛋白家族(圖4)。2.6具有過水解酶催化活性的酶蛋白3D結(jié)構(gòu)模擬

分別以已結(jié)構(gòu)解析的SCP(PDB數(shù)據(jù)庫：1AF4)、AXE(PDB數(shù)據(jù)庫：2XLB)和CAH(PDB數(shù)據(jù)庫：1ODS)為模板，對從B.subtilis NSYT-3菌株兊隆的SCP蛋白、B.pumilus OSLJ-13菌株兊隆的AXE蛋白和從B.subtilis NSYT-3菌株兊隆的CAH蛋白迚行同源建模，獲得的PDB文件經(jīng)YASARA軟件優(yōu)化并可視化后，從圖5A、5B和5C可以看出，模擬獲得的3D分子結(jié)構(gòu)均具有α/β水解酶折疊家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征，分子結(jié)構(gòu)中央均為系列β-折疊片層結(jié)構(gòu)，系列α-螺旋圍繞在β-折疊片層結(jié)構(gòu)的周圍。基于序列比對預(yù)測為催化三聯(lián)體的氨基酸殘基之間(分析數(shù)據(jù)未顯示，SCP蛋白高度保守的氨基酸殘基為Asp138、His170和Ser327;AXE蛋白高度保守的氨基酸殘基為Ser181、Asp269和His298;CAH蛋白高度保守的氨基酸殘基為Ser181、Asp269和His298)均可形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)(鍵長均在1.767?-1.826?之間，與氫鍵鍵長范圍相符，圖5D、5E和5F)。3討論與結(jié)論

【參考文獻】：
期刊論文
[1]從植物根際定向批量篩選廣譜有機溶劑耐受性脂肪酶產(chǎn)生菌[J]. 舒正玉,林瑞鳳,江歡,張巖峰,黃建忠.  微生物學(xué)通報. 2009(06)
[2]類似S-層蛋白的蘇云金芽胞桿菌伴胞晶體蛋白基因的克隆[J]. 孫明,朱晨光,喻子牛.  微生物學(xué)報. 2001(02)



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