GH43家族β-D-木糖苷酶RuXyn1在馬克斯克魯維酵母中的表達及其應(yīng)用
發(fā)布時間：2022-01-26 17:29
木聚糖的降解需要內(nèi)切β-木聚糖酶和β-D-木糖苷酶的協(xié)同作用,β-D-木糖苷酶能將β-木聚糖酶的水解產(chǎn)物木寡糖降解為木糖,因此在半纖維素的利用中具有重要的意義.本研究將中國牦牛瘤胃微生物來源的糖基水解酶GH43家族β-D-木糖苷酶基因RuXyn1克隆到含兩種不同分泌信號肽（菊粉酶信號肽和α-factor信號肽）的馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）分泌表達載體（pUKDN132和pUKDN129）中,轉(zhuǎn)化K.marxianus Fim-1 ura3Δ,通過篩選獲得兩株分泌表達β-D-木糖苷酶基因RuXyn1的重組菌株Fim-1/pUKDN132-RuXyn1和Fim-1/pUKDN129-RuXyn1.重組菌株搖瓶培養(yǎng)72h后,上清液中β-D-木糖苷酶酶活分別為0.304U/mL和0.045U/mL.在5L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵中,Fim-1/pUKDN132-RuXyn1分泌表達的β-D-木糖苷酶酶活為1.75U/mL,而Fim-1/pUKDN129-RuXyn1的酶活為1.6U/mL,表明在表達β-D-木糖苷酶RuXyn1時,菊粉酶信號肽介導(dǎo)的分泌效率優(yōu)于α...
【文章來源】：復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版). 2020,59(05)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：9 頁
【部分圖文】：
保留型與反轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶的催化反應(yīng)
圖4 K.marxianus重組菌株高密度發(fā)酵上清的SDS-PAGE檢測此外，我們還檢測了降解反應(yīng)過程中的葡萄糖釋放量，發(fā)現(xiàn)三酶混合組水解96h生成的葡萄糖量為63.65g/L，較二酶混合組和CTec2組分別提高了6.1%和13.7%(P<0.01）（圖5(c））．圖5(d）為水解96h各組樣品上清的HPLC檢測結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)三酶混合組在保留時間7.5min處的產(chǎn)木糖峰和11min處的產(chǎn)葡萄糖峰（圖5(d））高于二酶混合組和纖維素酶CTec2組．上述結(jié)果表明玉米芯酶解時，在β-木聚糖酶和纖維素酶CTec2中加入β-木糖苷酶RuXyn1能更顯著提高玉米芯的降解效率，釋放更多的葡萄糖和木糖．由于底物玉米芯中，半纖維素和纖維素緊密粘合并起著固定纖維素的作用[21]，β-木糖苷酶RuXyn1的加入促進了玉米芯中半纖維素的降解，釋放木糖，同時纖維素與酶的接觸反應(yīng)面積也隨之增加，在CTec2纖維素酶的水解作用下，水解纖維素產(chǎn)生了更多的葡萄糖．
為了檢測經(jīng)重組表達的木糖苷酶RuXyn1對玉米芯的水解能力，我們以2%稀酸預(yù)處理玉米芯為底物，測試了β-木糖苷酶RuXyn1與β-木聚糖酶、纖維素酶Cellic CTec2酶的組合降解玉米芯的效果．水解上清液中還原糖的DNS法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在β-木聚糖酶與纖維素酶CTec2中添加1U的β-木糖苷酶RuXyn1后，水解96h后產(chǎn)生的總還原糖量較β-木聚糖酶、纖維素酶CTec2組合酶和纖維素酶CTec2組分別提高了7%(P<0.05）和29.4%(P<0.01）（圖5(a））．表明β-木糖苷酶RuXyn1的加入顯著提高了玉米芯底物的水解效率．各組樣品上清液的HPLC檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-木糖苷酶RuXyn1、β-木聚糖酶與纖維素酶CTec2混合組水解96h生成的木糖量為9.13g/L，比β-木聚糖酶和纖維素酶CTec2或纖維素酶CTec2單酶水解分別提高了12.4%(P<0.05）和23.4%(P<0.01）（圖5(b））．其中，由于纖維素酶Cellic CTec2酶為復(fù)合酶，包含少量β-D-木糖苷酶（0.33IU/mg)[20]，故其單獨水解玉米芯的產(chǎn)物中也包含木糖．圖5 β-木糖苷酶RuXyn1提高稀酸處理玉米芯的酶法糖化效率
【參考文獻】：
期刊論文
[1]高濃玉米秸稈堿法預(yù)處理及半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝研究[J]. 連戰(zhàn),呂志飛,劉彬,劉欣,李喬丹,田冰,莊倩倩,劉同軍. 食品與發(fā)酵工業(yè). 2018(10)
[2]信號肽對木聚糖酶在馬克斯克魯維酵母中分泌表達的影響[J]. 吳玥,周峻崗,呂紅. 復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版). 2017(04)
[3]微生物產(chǎn)β-木糖苷酶的研究進展[J]. 范園園,李秀婷,滕超. 食品研究與開發(fā). 2013(12)
[4]秸桿中半纖維素的結(jié)構(gòu)及分離新方法綜述[J]. 許鳳,鐘新春,孫潤倉,詹懷宇. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè). 2005(S1)
[5]信號肽序列對畢赤酵母表達外源蛋白質(zhì)的影響[J]. 熊愛生,彭日荷,李賢,范惠琴,姚泉洪,郭美錦,張嗣良. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報. 2003(02)
本文編號：3610889
【文章來源】：復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版). 2020,59(05)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：9 頁
【部分圖文】：
保留型與反轉(zhuǎn)型β-木糖苷酶的催化反應(yīng)
圖4 K.marxianus重組菌株高密度發(fā)酵上清的SDS-PAGE檢測此外，我們還檢測了降解反應(yīng)過程中的葡萄糖釋放量，發(fā)現(xiàn)三酶混合組水解96h生成的葡萄糖量為63.65g/L，較二酶混合組和CTec2組分別提高了6.1%和13.7%(P<0.01）（圖5(c））．圖5(d）為水解96h各組樣品上清的HPLC檢測結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)三酶混合組在保留時間7.5min處的產(chǎn)木糖峰和11min處的產(chǎn)葡萄糖峰（圖5(d））高于二酶混合組和纖維素酶CTec2組．上述結(jié)果表明玉米芯酶解時，在β-木聚糖酶和纖維素酶CTec2中加入β-木糖苷酶RuXyn1能更顯著提高玉米芯的降解效率，釋放更多的葡萄糖和木糖．由于底物玉米芯中，半纖維素和纖維素緊密粘合并起著固定纖維素的作用[21]，β-木糖苷酶RuXyn1的加入促進了玉米芯中半纖維素的降解，釋放木糖，同時纖維素與酶的接觸反應(yīng)面積也隨之增加，在CTec2纖維素酶的水解作用下，水解纖維素產(chǎn)生了更多的葡萄糖．
為了檢測經(jīng)重組表達的木糖苷酶RuXyn1對玉米芯的水解能力，我們以2%稀酸預(yù)處理玉米芯為底物，測試了β-木糖苷酶RuXyn1與β-木聚糖酶、纖維素酶Cellic CTec2酶的組合降解玉米芯的效果．水解上清液中還原糖的DNS法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在β-木聚糖酶與纖維素酶CTec2中添加1U的β-木糖苷酶RuXyn1后，水解96h后產(chǎn)生的總還原糖量較β-木聚糖酶、纖維素酶CTec2組合酶和纖維素酶CTec2組分別提高了7%(P<0.05）和29.4%(P<0.01）（圖5(a））．表明β-木糖苷酶RuXyn1的加入顯著提高了玉米芯底物的水解效率．各組樣品上清液的HPLC檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，β-木糖苷酶RuXyn1、β-木聚糖酶與纖維素酶CTec2混合組水解96h生成的木糖量為9.13g/L，比β-木聚糖酶和纖維素酶CTec2或纖維素酶CTec2單酶水解分別提高了12.4%(P<0.05）和23.4%(P<0.01）（圖5(b））．其中，由于纖維素酶Cellic CTec2酶為復(fù)合酶，包含少量β-D-木糖苷酶（0.33IU/mg)[20]，故其單獨水解玉米芯的產(chǎn)物中也包含木糖．圖5 β-木糖苷酶RuXyn1提高稀酸處理玉米芯的酶法糖化效率
【參考文獻】：
期刊論文
[1]高濃玉米秸稈堿法預(yù)處理及半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝研究[J]. 連戰(zhàn),呂志飛,劉彬,劉欣,李喬丹,田冰,莊倩倩,劉同軍. 食品與發(fā)酵工業(yè). 2018(10)
[2]信號肽對木聚糖酶在馬克斯克魯維酵母中分泌表達的影響[J]. 吳玥,周峻崗,呂紅. 復(fù)旦學(xué)報(自然科學(xué)版). 2017(04)
[3]微生物產(chǎn)β-木糖苷酶的研究進展[J]. 范園園,李秀婷,滕超. 食品研究與開發(fā). 2013(12)
[4]秸桿中半纖維素的結(jié)構(gòu)及分離新方法綜述[J]. 許鳳,鐘新春,孫潤倉,詹懷宇. 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè). 2005(S1)
[5]信號肽序列對畢赤酵母表達外源蛋白質(zhì)的影響[J]. 熊愛生,彭日荷,李賢,范惠琴,姚泉洪,郭美錦,張嗣良. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報. 2003(02)
本文編號：3610889
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