通過(guò)構(gòu)建大腸桿菌（Escherichia coli）W3110 MetD吸收系統(tǒng)編碼基因metI、metN、metQ單個(gè)缺損菌株,獲得胞外蛋氨酸吸收速率最小菌株;游離及染色體整合表達(dá)YjeH和YeaS分泌系統(tǒng)編碼基因yjeH和yeaS,研究增強(qiáng)蛋氨酸分泌與弱化蛋氨酸吸收集成改造策略對(duì)菌體胞外蛋氨酸積累和生物量的影響,為理性構(gòu)建蛋氨酸高產(chǎn)菌株提供可行策略。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,基因metI的缺損對(duì)胞外蛋氨酸的吸收影響最大,吸收速率降低了16.7%;游離表達(dá)基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸開(kāi)始積累,胞外蛋氨酸最大積累量為0.21 g/L和0.18 g/L;染色體整合表達(dá)基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸的最大積累量為0.48 g/L和0.25 g/L,與游離表達(dá)相比提高了128%和38.9%。增強(qiáng)蛋氨酸分泌與弱化蛋氨酸吸收集成改造策略對(duì)于促進(jìn)胞外蛋氨酸的積累效果顯著,可以作為理性構(gòu)建蛋氨酸高產(chǎn)菌株的策略。 

【文章來(lái)源】：食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2020,39(03)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

蛋氨酸分析培養(yǎng)基中重組菌株生長(zhǎng)狀況

利用RT-qPCR比較了菌株M15相對(duì)于野生E.coli W3110 yjeH和yeaS基因的表達(dá)比率，結(jié)果如圖7所示，與原始菌株相比，yjeH、yeaS基因的表達(dá)水平分別提高了1.65倍和1.59倍。對(duì)M15(pET-ABY）和M16(pET-ABY）進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因yjeH、yeaS整合表達(dá)對(duì)蛋氨酸胞外分泌的影響，如圖8所示，M15(pET-ABY）和M16(pET-ABY）最大胞外蛋氨酸的積累量分別為0.48 g/L和0.25 g/L，蛋氨酸產(chǎn)率分別為0.13 g/g DCW和0.08 g/g DCW。與游離表達(dá)相比，其產(chǎn)量分別提高了128%和38.9%，產(chǎn)率提高了85.7%和60%。圖7 不同菌株yjeH轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的yjeH、yeaS基因過(guò)表達(dá)載體p KK-yjeH、p KK-yea S轉(zhuǎn)染M12，記錄菌體生長(zhǎng)以及胞外蛋氨酸積累情況。從圖3可以看出yjeH與yeaS的過(guò)表達(dá)在一定程度上均抑制了菌體的生長(zhǎng)，本研究室前期構(gòu)建用來(lái)表達(dá)解除了反饋抑制的高絲氨酸轉(zhuǎn)琥珀�；负驮鰪�(qiáng)蛋氨酸代謝過(guò)程中的γ-胱硫醚聚合酶以及β-胱硫醚酶[12]的質(zhì)粒pET-ABY的表達(dá)可以有效緩解生長(zhǎng)抑制。yjeH、yeaS的過(guò)量表達(dá)可能使大腸桿菌胞內(nèi)蛋氨酸質(zhì)量濃度過(guò)低，影響了大腸桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中所需要物質(zhì)的合成，菌體的生長(zhǎng)受到抑制，同時(shí)胞外蛋氨酸的質(zhì)量濃度過(guò)高也會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，質(zhì)粒pET-ABY的表達(dá)強(qiáng)化了蛋氨酸合成途徑，在基因交互作用的影響下其生長(zhǎng)抑制得到了有效緩解。對(duì)比M12(pET-ABY）、M12(pET-ABY/pKK-yjeH）和M12(pET-ABY/pKK-yeaS）發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)蛋氨酸的質(zhì)量濃度變化，如圖4所示，YjeH、YeaS運(yùn)輸系統(tǒng)的強(qiáng)化促進(jìn)了大腸桿菌向胞外分泌L-蛋氨酸，降低了胞內(nèi)L-蛋氨酸的積累，YjeH運(yùn)輸系統(tǒng)的效果更為顯著。我們對(duì)2種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)游離表達(dá)菌株進(jìn)行了發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5所示，YjeH與YeaS運(yùn)輸系統(tǒng)的表達(dá)都能夠在胞外積累一定量的蛋氨酸，其最大積累量分別為0.21 g/L和0.18 g/L，蛋氨酸產(chǎn)率分別為0.06 g/g DCW和0.05 g/g DCW。2.4 YjeH和YeaS在染色體上的整合表達(dá)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大腸桿菌MetD運(yùn)輸系統(tǒng)缺失對(duì)蛋氨酸積累的影響[J]. 李華,董偉,李由然,張梁,丁重陽(yáng),石貴陽(yáng).  微生物學(xué)通報(bào). 2017(06)
[2]大腸桿菌TdcC、SstT和LIV-1系統(tǒng)缺失對(duì)胞外L-蘇氨酸積累的影響[J]. 楊冬美,李華,李由然,張梁,丁重陽(yáng),李贏,顧正華,石貴陽(yáng).  微生物學(xué)通報(bào). 2017(01)
[3]大腸桿菌PTS系統(tǒng)改造及重組菌生長(zhǎng)性能測(cè)定[J]. 肖夢(mèng)榕,張梁,劉雙平,石貴陽(yáng).  生物工程學(xué)報(bào). 2014(10)
[4]過(guò)量表達(dá)蛋氨酸合成途徑基因?qū)χ亟M大腸桿菌產(chǎn)蛋氨酸的影響[J]. 屈更思,郭謙,方芳,堵國(guó)成,陳堅(jiān).  工業(yè)微生物. 2013(05)



本文編號(hào)：3592604