【目的】α-酮戊二酸脫羧酶（α-ketoglutaric acid decarboxylase,α-KGD）是藍(lán)細(xì)菌三羧酸循環(huán)途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。試驗(yàn)旨在優(yōu)化集胞藻PCC6803中sll1981基因編碼蛋白的原核表達(dá)方法,并對(duì)不同表達(dá)方法獲得的重組sll1981蛋白進(jìn)行活性測定�！痉椒ā坷梅肿由飳W(xué)技術(shù)構(gòu)建含有sll1981基因的多種表達(dá)載體,通過SDSPAGE分析這些表達(dá)載體在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)和可溶性情況,利用Ni-NTA親和層析分離純化重組sll1981蛋白,然后通過酶偶聯(lián)法測定重組sll1981蛋白的催化活性�！窘Y(jié)果】含有sll1981基因的不同表達(dá)載體在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)良好,然而重組sll1981蛋白的可溶性和催化活性差異較大�！窘Y(jié)論】當(dāng)pET28bsll1981質(zhì)粒與pTf16分子伴侶質(zhì)粒在大腸桿菌中共表達(dá)時(shí)重組sll1981蛋白的可溶性和催化活性均為最佳。酶動(dòng)力學(xué)測試表明集胞藻PCC6803中sll1981基因編碼蛋白具有α-酮戊二酸脫羧酶功能。為進(jìn)一步研究α-酮戊二酸脫羧酶的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系及催化機(jī)制提供重要基礎(chǔ)。 

【文章來源】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,42(03)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

集胞藻PCC6803的sll1981基因PCR擴(kuò)增和菌落PCR鑒定

在大腸桿菌中自誘導(dǎo)表達(dá)外源基因獲得重組蛋白的方法簡便易操作，因此本研究也探索了自誘導(dǎo)表達(dá)方式對(duì)pET28b-sll1981重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)重組sll1981蛋白的影響。結(jié)果表明，在16℃時(shí)自誘導(dǎo)16 h沒有誘導(dǎo)表達(dá)sll1981蛋白，自誘導(dǎo)20 h后該菌株表達(dá)了非常少量的sll1981蛋白。當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)24 h后sll1981蛋白被大量表達(dá)。因此，采用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基也能有效表達(dá)重組sll1981蛋白，然而此方法表達(dá)的sll1981蛋白可溶性并沒有顯著提高（圖5A）。此前研究表明過表達(dá)分子伴侶蛋白可以促進(jìn)目的蛋白的折疊，從而提高重組蛋白的可溶性。本研究采用pET28b-sll1981重組質(zhì)粒與分子伴侶質(zhì)粒pTf16共轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)sll1981蛋白的方式，其結(jié)果如圖5B所示。分子伴侶質(zhì)粒pTf16表達(dá)的觸發(fā)因子tig蛋白大小為56 ku，比目的蛋白sll1981小，與電泳結(jié)果中顯示的tig蛋白處于sll1981蛋白下方一致，下圖接近55 ku的蛋白分子即為觸發(fā)因子tig蛋白。由圖5B可知，與分子伴侶質(zhì)粒pTf16共表達(dá)可以顯著提高sll1981蛋白的可溶性。同時(shí)筆者也構(gòu)建了pET32a-sll1981和pColdTF-sll1981重組質(zhì)粒，其分別含有可能提高重組蛋白可溶性的Trx和觸發(fā)因子TF標(biāo)簽。研究結(jié)果表明sll1981蛋白連接Trx標(biāo)簽后其可溶性沒有顯著提高，然而sll1981蛋白連接TF標(biāo)簽后其可溶性顯著提高，表達(dá)的sll1981蛋白基本都在上清中（圖5C）。圖3 不同溫度下重組sll1981蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

不同溫度下重組sll1981蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3590254