為了構(gòu)建具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi表達(dá)載體來研究擬南芥AtZFN3基因表達(dá)的效果。根據(jù)擬南芥（Arabidopsis thaliana）鋅指蛋白AtZFN3基因序列,設(shè)計含有酶切位點的兩對特異性引物。以擬南芥cDNA為模板,分別合成用于構(gòu)建干擾載體的正、反義DNA片段,將正、反義片段分別插入表達(dá)載體pART27的相應(yīng)位置上,構(gòu)建含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi載體pART-ZFN3。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將pART-ZFN3轉(zhuǎn)化到擬南芥中,PCR檢測證實獲得了5株轉(zhuǎn)基因植株,經(jīng)熒光定量PCR檢測,證明了轉(zhuǎn)基因植株中AtZFN3基因表達(dá)量顯著低于未轉(zhuǎn)基因的植株。結(jié)果表明:具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi載體pART-ZFN3已構(gòu)建成功,它對擬南芥AtZFN3基因的表達(dá)具有抑制作用,為深入分析擬南芥AtZFN3基因功能提供了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：分子植物育種. 2020,18(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

pKA-F-R質(zhì)粒PCR檢測

酶切分析

將質(zhì)粒pKA-F-R和pART27質(zhì)粒分別用NotⅠ進(jìn)行單酶切，純化回收的目的片段連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取具有卡那霉素抗性的單克隆菌落，使用pdk-f和pdk-r作為引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示：獲得了預(yù)期大小的DNA條帶。使用NotⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，經(jīng)電泳分析，得到預(yù)期大小一致的條帶(圖3)。將重組質(zhì)粒送生物公司測序，結(jié)果得知pART-ZFN3質(zhì)粒構(gòu)建正確。以上結(jié)果表明，成功構(gòu)建了擬南芥鋅指蛋白AtZFN3基因RNAi表達(dá)載體。圖2 pKA-F-R質(zhì)粒PCR檢測

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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