前期研究表明在擬南芥中通過(guò)增強(qiáng)MAN3基因表達(dá),可以增強(qiáng)甘露聚糖水解酶的活性,使細(xì)胞壁中的甘露糖含量增多,從而增強(qiáng)植株對(duì)重金屬鎘的積累和耐受。已有文獻(xiàn)報(bào)道在辣椒中,MNB1的同源蛋白Ca MBL1的GNA結(jié)構(gòu)域能夠與甘露糖特異性結(jié)合。擬南芥中MNB1蛋白中同樣存在GNA結(jié)構(gòu)域,尚不清楚MNB1蛋白的GNA結(jié)構(gòu)域是否與MAN3介導(dǎo)的甘露糖調(diào)節(jié)擬南芥鎘耐受的分子機(jī)制有關(guān)。因此本課題在前期研究已證明MNB1參與重金屬鎘脅迫響應(yīng)調(diào)控基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)MNB1蛋白的GNA結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)擬南芥鎘耐受的分子機(jī)制進(jìn)行研究,獲得了如下研究結(jié)果。1.為研究MNB1基因是否被鎘脅迫誘導(dǎo),克隆了MNB1啟動(dòng)子并構(gòu)建了Pro MNB1-GUS轉(zhuǎn)基因植株。GUS染色分析表明,在鎘脅迫下,轉(zhuǎn)基因幼苗的根和葉的藍(lán)色明顯要比對(duì)照深,表明MNB1基因被鎘脅迫誘導(dǎo)。2.構(gòu)建了一系列MNB1蛋白缺失表達(dá)載體并進(jìn)行蛋白原核表達(dá),同時(shí)進(jìn)行甘露糖結(jié)合分析。發(fā)現(xiàn)只含有GNA結(jié)構(gòu)域的MNB1蛋白能夠與甘露糖結(jié)合。從生化角度證明表明MNB1蛋白的GNA結(jié)構(gòu)域是MNB1蛋白與甘露糖結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。3.構(gòu)建了GNA結(jié)構(gòu)域缺失的轉(zhuǎn)基因植株材料MN... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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擬南芥MNB1同源分析

第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析433.1.2MNB1的蛋白序列分析通過(guò)分析生物信息學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)和查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)MNB1的蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3.2所示，該圖為MNB1的cDNA核苷酸序列和推導(dǎo)的編碼GNA相關(guān)凝集素蛋白的氨基酸序列。其中，上排為cDNA核苷酸，全長(zhǎng)1368bp，下排為氨基酸序列，包含455個(gè)氨基酸；前端的黃色區(qū)域?yàn)镾P信號(hào)肽序列，包含22個(gè)氨基酸；帶有紅色下劃線的區(qū)域?yàn)橥贫ǖ腉NA結(jié)構(gòu)域，位于蛋白序列的第40個(gè)氨基酸到第191個(gè)氨基酸之間，包含151個(gè)氨基酸；紅色背景中的序列是推定的N-糖基化，末端的星號(hào)代表終止密碼子。根據(jù)此蛋白序列，我們后續(xù)構(gòu)建了一系列MNB1蛋白GNA結(jié)構(gòu)域缺失相關(guān)表達(dá)載體。圖3.2MNB1編碼蛋白的cDNA核苷酸序列和推定的氨基酸序列分析Fig3.2NucleotideanddeducedaminoacidsequencesanalysisofMNB1cDNAencodingprotein.3.2ProMNB1-GUS轉(zhuǎn)基因株系構(gòu)建及表達(dá)分析3.2.1擬南芥MNB1基因啟動(dòng)子的克隆為了進(jìn)一步證明MNB1響應(yīng)重金屬鎘脅迫，我們構(gòu)建了ProMNB1-GUS轉(zhuǎn)基因株系。首先構(gòu)建ProMNB1-GUS表達(dá)載體。在擬南芥TAIR網(wǎng)站（www.arabidopsis.org）上查詢到長(zhǎng)度為2008bp的MNB1基因（At1g78830）的啟動(dòng)子序列，作為目的片段，利用Primerpremier5.0軟件設(shè)計(jì)目的片段引物。提

合肥工業(yè)大學(xué)碩士論文44取野生型植株基因組DNA作為模板進(jìn)行目的片段克攏克隆結(jié)果如圖3.3所示，M代表Marker，1代表目的片段，條帶大小與所選取的啟動(dòng)子區(qū)域長(zhǎng)度一致。圖3.3MNB1基因啟動(dòng)子克隆Fig3.3CloningofpromoterofMNB1gene3.2.2目的片段與載體的雙酶切通過(guò)限制性內(nèi)切酶KpnI/XhoI分別對(duì)克隆的目的片段和GUS空載進(jìn)行雙酶切。本實(shí)驗(yàn)所用GUS空載為改造后的pART27載體，載體上加入了KpnI及XhoI酶切位點(diǎn)。酶切后進(jìn)行電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果如圖3.4A所示，M1代表2kbMarker，1代表酶切后的目的片段，M2代表10kbMarker，2代表酶切后的載體。3.2.3ProMNB1-GUS重組載體的連接轉(zhuǎn)化酶切產(chǎn)物通過(guò)膠回收純化后，通過(guò)T4-DNALigase連接目的片段和載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，從抗性平板上挑取單菌落，小接于抗性LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，進(jìn)行菌落PCR。鑒定結(jié)果如圖3.4B所示，M代表Marker，隨機(jī)選取的12個(gè)菌落中，1、4、5、7、8、9、11、12號(hào)顯示出明亮條帶，選取1號(hào)和4號(hào)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，克隆獲得的序列正是擬南芥MNB1的啟動(dòng)子的目標(biāo)片段。AB圖3.4ProMNB1-GUS重組載體的酶切與大腸桿菌陽(yáng)性菌株鑒定Fig3.4DigestionofProMNB1-GUSrecombinantvectorandidentificationofE.colipositivestrains

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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