血管化人腦類器官的構(gòu)建及其功能研究
發(fā)布時間：2022-01-09 13:57
人腦在結(jié)構(gòu)和功能上是生物體中最復(fù)雜的器官之一,人腦的復(fù)雜性給研究這個獨(dú)特器官的發(fā)育和功能異常帶來了巨大的挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)上研究人員通常使用動物模型來研究成人腦的發(fā)育及其疾病。但動物腦模型和人腦之間存在較大差異,無法對人類大腦特異性特征進(jìn)行研究,對于人腦特有的病理功能研究更是不可能的。在體外對多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),可以建立三維的神經(jīng)組織發(fā)育模型,細(xì)胞能夠自組織成復(fù)雜的腦結(jié)構(gòu),被稱為人腦類器官。目前,體外培養(yǎng)的人腦類器官主要存在幾個不能忽視的問題:長時間培養(yǎng)中心細(xì)胞壞死和神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育不夠成熟。本論文開發(fā)了構(gòu)建血管化人腦類器官的培養(yǎng)平臺,以此實現(xiàn)對人腦類器官的長期穩(wěn)定培養(yǎng),獲得更加成熟的人腦類器官培養(yǎng)模型。論文以氧化海藻酸鈉（OSA）和明膠（GTN）混合與氯化鈣進(jìn)行交聯(lián)構(gòu)建生物活性復(fù)合水凝膠體系為人腦類器官中神經(jīng)細(xì)胞的增殖和遷移提供適當(dāng)?shù)募?xì)胞外環(huán)境。水凝膠材料所選體系為1.5%OSA,4.5%GTN和100 mmol/L CaCl2,既可以保障人腦類器官的發(fā)育成熟,又可提供足夠的力學(xué)性能用于移植。免疫缺陷鼠腹腔腹膜富含大量的毛細(xì)血管,是腹膜腔內(nèi)高度血管化的結(jié)構(gòu),可以支持人腦類器...
【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 985工程院校
【文章頁數(shù)】：64 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
人腦類器官培養(yǎng)過程[2]
哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-4-們發(fā)現(xiàn)人腦類器官體中的不僅僅有星型膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)上皮細(xì)胞等成分，還有廣泛且多樣的神經(jīng)細(xì)胞，包括多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，前腦神經(jīng)細(xì)胞，甚至有在視網(wǎng)膜中廣泛存在的感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和雙極細(xì)胞（圖1-2）。進(jìn)一步的分析還發(fā)現(xiàn)了上述細(xì)胞還存在多種亞型，說明人腦類器官中細(xì)胞有極高的多樣性。各種神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)逐漸發(fā)育成熟，產(chǎn)生樹突棘等結(jié)構(gòu)，這表明它們正在與其他神經(jīng)細(xì)胞建立連接。除此之外，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞進(jìn)一步分化成視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞，與人體中自然生長的過程十分相似。圖1-2人腦類器官中細(xì)胞類型的多樣性[12]少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中除神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞外第三主要的細(xì)胞類型，少突膠質(zhì)細(xì)胞對健康大腦來說必不可少，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病都是由少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘缺陷引起的，包括多發(fā)性硬化和罕見的兒科疾玻在類腦器官培養(yǎng)中，Madhavan[13]等通過用血小板衍生生長因子AA（PDGF-AA）和胰島素樣生長因子1（IGF-1）在類器官皮質(zhì)球模型中獲得了少突膠質(zhì)祖細(xì)胞種群，然后使用甲狀腺激素（T3）誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，最終在配第60-70天髓鞘形成。少突膠質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)能更準(zhǔn)確地再現(xiàn)人類大腦發(fā)育過程中細(xì)胞間的相互作用情況。之前這些生產(chǎn)人腦類器官的方案都存在一個所謂“批量綜合征”的問題，它們不僅在來自不同實驗室或不同患者的類器官之間，而且在來自同一iPSCs來源的類器官之間也顯示出顯著的差異性[14]。這限制人腦類器官在藥物篩選這種需要高通量同性質(zhì)模型上的應(yīng)用。有研究表明通過使用均質(zhì)水凝，特別是，
哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-6-同的RI會散射入射光。此外，內(nèi)源性色素包括血紅素、脂褐素和黑色素都會阻礙了光的傳播[18]。組織透明化可大大提高組織成像的清晰度，更利于觀察深層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，研究大塊組織或完整器官。目前最新的組織透明化技術(shù)為PEGASOS透明化技術(shù)。組織清除方法根據(jù)使用清除組織試劑的組成可分為兩大類：有機(jī)溶劑透明化和水試劑透明化。PEGASOS是一種新型油性透明化試劑，是基于聚乙二醇（PEG）相關(guān)溶劑體系的組織透明化方法[19]。實驗證明，PEGASOS方法能使幾乎所有類型的組織透明（圖1-3），除了色素上皮也包括骨頭和牙齒在內(nèi)的硬組織，在透明化后幾乎看不見上述組織。而且透明化介質(zhì)中的聚乙二醇成分可對內(nèi)源性熒光提供長期保護(hù)[20]。使用PEGASOS透明化法，能對完整的小鼠大腦進(jìn)行成像，并對單個軸突和神經(jīng)元進(jìn)行了遠(yuǎn)距離追蹤。該研究方法能夠通過椎骨成像來識別周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）之間的聯(lián)系，還揭示了長骨骨髓內(nèi)的神經(jīng)分布模式。圖1-3組織透明化技術(shù)[19]1.2.3人腦類器官用于疾病模型的研究人腦類器官可在體外模擬神經(jīng)發(fā)育紊亂，CDK5RAP2基因的截斷突變影響新皮質(zhì)祖細(xì)胞，導(dǎo)致整個大腦變校然而，之前的研究是在小鼠模型上進(jìn)行的，這些模型并沒有重現(xiàn)人類小頭畸形的癥狀。Lancaster用來自嚴(yán)重小頭畸形的CDK5RAP2截斷突變患者的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPSC細(xì)胞并以此構(gòu)建人腦類器官。如圖1-4所示，這種人腦類器官已經(jīng)顯示出一種原始的表型，比野生型的人腦類器官要校對病人源性類器官中神經(jīng)祖細(xì)胞的分析顯示，它們有絲分裂區(qū)平面面積增加，而這些分裂區(qū)平面不垂直于腦室表面。這與野生型的情況相反，野生型中神經(jīng)祖細(xì)胞垂直于腦室表面分裂可以維持祖細(xì)胞位置穩(wěn)定，同時這種分裂方式對于維持細(xì)?
本文編號：3578850
【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 985工程院校
【文章頁數(shù)】：64 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
人腦類器官培養(yǎng)過程[2]
哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-4-們發(fā)現(xiàn)人腦類器官體中的不僅僅有星型膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)上皮細(xì)胞等成分，還有廣泛且多樣的神經(jīng)細(xì)胞，包括多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞，前腦神經(jīng)細(xì)胞，甚至有在視網(wǎng)膜中廣泛存在的感光細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和雙極細(xì)胞（圖1-2）。進(jìn)一步的分析還發(fā)現(xiàn)了上述細(xì)胞還存在多種亞型，說明人腦類器官中細(xì)胞有極高的多樣性。各種神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)逐漸發(fā)育成熟，產(chǎn)生樹突棘等結(jié)構(gòu)，這表明它們正在與其他神經(jīng)細(xì)胞建立連接。除此之外，視網(wǎng)膜感光細(xì)胞進(jìn)一步分化成視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞，與人體中自然生長的過程十分相似。圖1-2人腦類器官中細(xì)胞類型的多樣性[12]少突膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中除神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞外第三主要的細(xì)胞類型，少突膠質(zhì)細(xì)胞對健康大腦來說必不可少，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病都是由少突膠質(zhì)細(xì)胞髓鞘缺陷引起的，包括多發(fā)性硬化和罕見的兒科疾玻在類腦器官培養(yǎng)中，Madhavan[13]等通過用血小板衍生生長因子AA（PDGF-AA）和胰島素樣生長因子1（IGF-1）在類器官皮質(zhì)球模型中獲得了少突膠質(zhì)祖細(xì)胞種群，然后使用甲狀腺激素（T3）誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，最終在配第60-70天髓鞘形成。少突膠質(zhì)細(xì)胞的出現(xiàn)能更準(zhǔn)確地再現(xiàn)人類大腦發(fā)育過程中細(xì)胞間的相互作用情況。之前這些生產(chǎn)人腦類器官的方案都存在一個所謂“批量綜合征”的問題，它們不僅在來自不同實驗室或不同患者的類器官之間，而且在來自同一iPSCs來源的類器官之間也顯示出顯著的差異性[14]。這限制人腦類器官在藥物篩選這種需要高通量同性質(zhì)模型上的應(yīng)用。有研究表明通過使用均質(zhì)水凝，特別是，
哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文-6-同的RI會散射入射光。此外，內(nèi)源性色素包括血紅素、脂褐素和黑色素都會阻礙了光的傳播[18]。組織透明化可大大提高組織成像的清晰度，更利于觀察深層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，研究大塊組織或完整器官。目前最新的組織透明化技術(shù)為PEGASOS透明化技術(shù)。組織清除方法根據(jù)使用清除組織試劑的組成可分為兩大類：有機(jī)溶劑透明化和水試劑透明化。PEGASOS是一種新型油性透明化試劑，是基于聚乙二醇（PEG）相關(guān)溶劑體系的組織透明化方法[19]。實驗證明，PEGASOS方法能使幾乎所有類型的組織透明（圖1-3），除了色素上皮也包括骨頭和牙齒在內(nèi)的硬組織，在透明化后幾乎看不見上述組織。而且透明化介質(zhì)中的聚乙二醇成分可對內(nèi)源性熒光提供長期保護(hù)[20]。使用PEGASOS透明化法，能對完整的小鼠大腦進(jìn)行成像，并對單個軸突和神經(jīng)元進(jìn)行了遠(yuǎn)距離追蹤。該研究方法能夠通過椎骨成像來識別周圍神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）之間的聯(lián)系，還揭示了長骨骨髓內(nèi)的神經(jīng)分布模式。圖1-3組織透明化技術(shù)[19]1.2.3人腦類器官用于疾病模型的研究人腦類器官可在體外模擬神經(jīng)發(fā)育紊亂，CDK5RAP2基因的截斷突變影響新皮質(zhì)祖細(xì)胞，導(dǎo)致整個大腦變校然而，之前的研究是在小鼠模型上進(jìn)行的，這些模型并沒有重現(xiàn)人類小頭畸形的癥狀。Lancaster用來自嚴(yán)重小頭畸形的CDK5RAP2截斷突變患者的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生iPSC細(xì)胞并以此構(gòu)建人腦類器官。如圖1-4所示，這種人腦類器官已經(jīng)顯示出一種原始的表型，比野生型的人腦類器官要校對病人源性類器官中神經(jīng)祖細(xì)胞的分析顯示，它們有絲分裂區(qū)平面面積增加，而這些分裂區(qū)平面不垂直于腦室表面。這與野生型的情況相反，野生型中神經(jīng)祖細(xì)胞垂直于腦室表面分裂可以維持祖細(xì)胞位置穩(wěn)定，同時這種分裂方式對于維持細(xì)?
本文編號：3578850
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