miRNA是一段長約22 nt的RNA小分子,它可以影響植物多種生理生化功能。STTM技術是研究miRNA功能的方法之一,它雖然可以阻止miRNA的活性,但無法在基因水平對其進行編輯,進而研究單個miRNA的功能。CRISPR/Cas9是近年來發(fā)展的可以靶向編輯DNA序列的技術,已廣泛應用于多種植物。本項研究中,我們試圖在擬南芥中利用CRISPR/Cas9技術建立鑒定miRNA功能的方法和技術體系,在水稻中驗證其可行性,并對其靶基因開展進一步研究。首先,分別用STTM與CRISPR/Cas9技術鑒定擬南芥miR171a的功能,發(fā)現(xiàn)兩種技術都可以使擬南芥miR171a的表達量降低,靶基因SCL22、SCL27的表達量下調,靶基因SCL6的表達量上調,葉綠素、脯氨酸含量下降、生長勢和抗旱能力減弱。在使用CRISPR技術敲除miR171a時,獲得了單堿基插入的突變,可以在一定程度上影響miR171a的活性,但效率沒有STTM高。這說明CRISPR技術驗證miR171a的功能是可行的。其次,為明確miR171在水稻中的功能,構建了包含miR171a雙靶點靶向miR171a前體的CRISPR載體... 

【文章來源】：海南大學海南省 211工程院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２?ＣＲ丨ＳＰＲ結構??

（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ?ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）指導ＡＧ０１降解耙基因或抑制祀基因翻譯??（Ｂｏｈｍｅｒｔ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１４；?Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ，?２００８；李超等，２００９）。而ｍｉＲＮＡ＊—般則被迅速降解。??相關步驟如圖３所示。??ｒ?ｃｉ?ｔｓｓｒ??＾?（＇ｐ〇ｎｉ?ｒ＊％ｍ〇?ＳＩ??？?■?ＭＩＲ?？?Ｏｔｆｗｒ?ＴＦ，??Ｗ／Ｒｐｒ〇ｍｏ？ｅｆ?＾??，ＰｈｏｓｐｆＨＭａｇｕｉａＪｉｏｎ?Ｓｐｆｃｏｏ＾＾ｖＭｅｄ??Ｄｉｃｉｎｇ?ｂｏｄｙ??＼?ｆ?／?Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ?ｓｐｉｃ＊ｎ０－?Ｕｎｋｎｏｗｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ??＼???／?ｌｕｎｃ？ｏｏｓ??＇?ＳＥｉ＾?／?＇?：?Ｏ００１?????似１?ｏｉＪ＾ｉｒ０?２．＇°＇ｍａｈｙｔｅｔｏ＇??Ｉ??Ｎｕｃｌｅｕｓ??一＾??Ｃ＞ＷＰｌａＳｍ?Ｃ＿?＇?＂＇Ｓ－－＾ＳＰ９０??〇?？??ＡＧＯｆ?ＡＧ０１?’?ＥＭＡ１??圖３?ｍｉｃｒｏＲＮＡ?（ｍｉＲＮＡ）生物發(fā)生的主要步驟（Ｙｕ?ｅｔ?ａ丨？，２０１７）??Ｆｉｇ．３?Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｍａｊｏｒ?ｓｔｅｐｓ?ｉｎ?ｍｉｃｒｏＲＮＡ?（ｍｉＲＮＡ）?ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ??１．２．２?ｍｉＲＮＡ的作用機制??ｍｉＲＮＡ作用于ｍＲＮＡ主要通過降解祀基因，抑制耙基因兩種方式。不同ｍｉＲＮＡ??作用方式取決于ｍｉＲＮＡ與其靶位點的序列匹配程度。一般來說，ｍｉＲＮＡ與靶ｍＲＮＡ??完全互補或近完全匹配時，會切割降解靶ｍＵＮＡ；兩者不完全匹配時，會抑制靶ｍＲＮＡ??翻譯。??除了這兩種方式

?海南大學碩士學位論文數(shù)據(jù)處理使用ＩＢＭ?ＳＰＳＳ?２３．０軟件，采用單因素ＡＮＯＶＡ分析時，選擇Ｔｕｋｅｙ－??方差齊性檢驗。繪圖使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７軟件。??２．?１．２實驗方法??（１）靶位點的選取??登錄?ｍｉＲＢａｓｅ?數(shù)據(jù)庫（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍｉｍａ＿ｅｎｔｒｖ．ｐｌ７ａｃｃ??＝ＭＩ００００２１４）獲得ｚｎ；７？／７／ｆｌ前體序列（基因登錄號：ＭＩ００００２１４）及二級結構。將??前體序列放入?ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ?網(wǎng)站（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ??／ＣＲＩＳＰＲ７ＣＲＩＳＰＲ＃）獲得靶位點，并從中挑選合適的２個，分別位于ｍｉＲＮＡ的５’的??成熟區(qū)ｓｇＲＮＡ－Ａ和莖環(huán)序列ｓｇＲＮＡ－Ｂ上（圖４）：??Ａ：ＡＧＧＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧ，?Ｂ：?ＧＴＡＴＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＧ??５＊?ＡＴ６Ａ６Ａ６ＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＡＴＡＴＴ６ＧＣＣＴＧ６ＴＴＣＡＣＴＣＡ６ＡＴＣＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＣＡＣＧ１Ａ６ＡＴＡＴＡＣＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣ１Ａ６ＡＴＴＡＴＣＴＧＡＴＴ６Ａ６ＣＣＧＣ６ＣＣＡＡ１ＡＴＣＴＣＡ６ＴＡＣＩＣＴＣＴＣ０Ｔ?３＊??（．．．．，．．．．．?????．．．．．．．?．．．．．４????Ｉ??＊???？???Ｉ???１???１—Ｈ?１２３??３？?ＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＡＡＴＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴ６ＣＡＴＣＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＡＴＡＧＡＣＴＡＡＣＴＣ６ＧＣＣＣＧ

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3571505