發(fā)布時(shí)間：2022-01-06 02:07

　　miRNA是一段長(zhǎng)約22 nt的RNA小分子,它可以影響植物多種生理生化功能。STTM技術(shù)是研究miRNA功能的方法之一,它雖然可以阻止miRNA的活性,但無(wú)法在基因水平對(duì)其進(jìn)行編輯,進(jìn)而研究單個(gè)miRNA的功能。CRISPR/Cas9是近年來(lái)發(fā)展的可以靶向編輯DNA序列的技術(shù),已廣泛應(yīng)用于多種植物。本項(xiàng)研究中,我們?cè)噲D在擬南芥中利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立鑒定miRNA功能的方法和技術(shù)體系,在水稻中驗(yàn)證其可行性,并對(duì)其靶基因開(kāi)展進(jìn)一步研究。首先,分別用STTM與CRISPR/Cas9技術(shù)鑒定擬南芥miR171a的功能,發(fā)現(xiàn)兩種技術(shù)都可以使擬南芥miR171a的表達(dá)量降低,靶基因SCL22、SCL27的表達(dá)量下調(diào),靶基因SCL6的表達(dá)量上調(diào),葉綠素、脯氨酸含量下降、生長(zhǎng)勢(shì)和抗旱能力減弱。在使用CRISPR技術(shù)敲除miR171a時(shí),獲得了單堿基插入的突變,可以在一定程度上影響miR171a的活性,但效率沒(méi)有STTM高。這說(shuō)明CRISPR技術(shù)驗(yàn)證miR171a的功能是可行的。其次,為明確miR171在水稻中的功能,構(gòu)建了包含miR171a雙靶點(diǎn)靶向miR171a前體的CRISPR載體... 

【文章來(lái)源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：75 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２?ＣＲ丨ＳＰＲ結(jié)構(gòu)??

（ＲＮＡ－ｉｎｄｕｃｅｄ?ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ?ｃｏｍｐｌｅｘ，ＲＩＳＣ）指導(dǎo)ＡＧ０１降解耙基因或抑制祀基因翻譯??（Ｂｏｈｍｅｒｔ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１４；?Ｖａｕｃｈｅｒｅｔ，?２００８；李超等，２００９）。而ｍｉＲＮＡ＊—般則被迅速降解。??相關(guān)步驟如圖３所示。??ｒ?ｃｉ?ｔｓｓｒ??＾?（＇ｐ〇ｎｉ?ｒ＊％ｍ〇?ＳＩ??？?■?ＭＩＲ?？?Ｏｔｆｗｒ?ＴＦ，??Ｗ／Ｒｐｒ〇ｍｏ？ｅｆ?＾??，ＰｈｏｓｐｆＨＭａｇｕｉａＪｉｏｎ?Ｓｐｆｃｏｏ＾＾ｖＭｅｄ??Ｄｉｃｉｎｇ?ｂｏｄｙ??＼?ｆ?／?Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ?ｓｐｉｃ＊ｎ０－?Ｕｎｋｎｏｗｎ?ｍｏｌｅｃｕｌａｒ??＼???／?ｌｕｎｃ？ｏｏｓ??＇?ＳＥｉ＾?／?＇?：?Ｏ００１?????似１?ｏｉＪ＾ｉｒ０?２．＇°＇ｍａｈｙｔｅｔｏ＇??Ｉ??Ｎｕｃｌｅｕｓ??一＾??Ｃ＞ＷＰｌａＳｍ?Ｃ＿?＇?＂＇Ｓ－－＾ＳＰ９０??〇?？??ＡＧＯｆ?ＡＧ０１?’?ＥＭＡ１??圖３?ｍｉｃｒｏＲＮＡ?（ｍｉＲＮＡ）生物發(fā)生的主要步驟（Ｙｕ?ｅｔ?ａ丨？，２０１７）??Ｆｉｇ．３?Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ｍａｊｏｒ?ｓｔｅｐｓ?ｉｎ?ｍｉｃｒｏＲＮＡ?（ｍｉＲＮＡ）?ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ??１．２．２?ｍｉＲＮＡ的作用機(jī)制??ｍｉＲＮＡ作用于ｍＲＮＡ主要通過(guò)降解祀基因，抑制耙基因兩種方式。不同ｍｉＲＮＡ??作用方式取決于ｍｉＲＮＡ與其靶位點(diǎn)的序列匹配程度。一般來(lái)說(shuō)，ｍｉＲＮＡ與靶ｍＲＮＡ??完全互補(bǔ)或近完全匹配時(shí)，會(huì)切割降解靶ｍＵＮＡ；兩者不完全匹配時(shí)，會(huì)抑制靶ｍＲＮＡ??翻譯。??除了這兩種方式

?海南大學(xué)碩士學(xué)位論文數(shù)據(jù)處理使用ＩＢＭ?ＳＰＳＳ?２３．０軟件，采用單因素ＡＮＯＶＡ分析時(shí)，選擇Ｔｕｋｅｙ－??方差齊性檢驗(yàn)。繪圖使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ７軟件。??２．?１．２實(shí)驗(yàn)方法??（１）靶位點(diǎn)的選取??登錄?ｍｉＲＢａｓｅ?數(shù)據(jù)庫(kù)（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｍｉｍａ＿ｅｎｔｒｖ．ｐｌ７ａｃｃ??＝ＭＩ００００２１４）獲得ｚｎ；７？／７／ｆｌ前體序列（基因登錄號(hào)：ＭＩ００００２１４）及二級(jí)結(jié)構(gòu)。將??前體序列放入?ＣＲＩＳＰＲ－Ｐ?網(wǎng)站（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｈｚａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ／ｃｇｉ－ｂｉｎ??／ＣＲＩＳＰＲ７ＣＲＩＳＰＲ＃）獲得靶位點(diǎn)，并從中挑選合適的２個(gè)，分別位于ｍｉＲＮＡ的５’的??成熟區(qū)ｓｇＲＮＡ－Ａ和莖環(huán)序列ｓｇＲＮＡ－Ｂ上（圖４）：??Ａ：ＡＧＧＴＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＴＧＡＡＣＣＡＧＧ，?Ｂ：?ＧＴＡＴＡＴＣＴＡＣＧＴＧＴＧＴＧＧＴＣＡＧＧ??５＊?ＡＴ６Ａ６Ａ６ＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＡＴＡＴＴ６ＧＣＣＴＧ６ＴＴＣＡＣＴＣＡ６ＡＴＣＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＡＣＡＣＡＣＧ１Ａ６ＡＴＡＴＡＣＡＴＴＡＴＴＣＴＣＴＣ１Ａ６ＡＴＴＡＴＣＴＧＡＴＴ６Ａ６ＣＣＧＣ６ＣＣＡＡ１ＡＴＣＴＣＡ６ＴＡＣＩＣＴＣＴＣ０Ｔ?３＊??（．．．．，．．．．．?????．．．．．．．?．．．．．４????Ｉ??＊???？???Ｉ???１???１—Ｈ?１２３??３？?ＴＡＣＴＣＴＣＴＣＡＧＧＧＡＡＡＣＴＡＴＡＡＣＣＧＧＡＣＣＡＡＧＴＧＡＣＴＣＴＡＣＡＡＴＣＧＡＣＴＧＧＴＧＴＣＴ６ＣＡＴＣＴＡＴＡＴＧＴＡＡＴＡＡＧＡＧＡＧＡＴＣＴＡＡＴＡＧＡＣＴＡＡＣＴＣ６ＧＣＣＣＧ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]植物miRNA靶基因驗(yàn)證研究進(jìn)展[J]. 何炫程,呂鶴書(shū),黃捷飛,馬蘭青,楊明峰.  生物技術(shù)進(jìn)展. 2017(02)
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[3]楊樹(shù)MIR171基因家族進(jìn)化與功能分化研究[J]. 劉志祥,曾超珍,曾渭賢,徐剛標(biāo),譚曉風(fēng).  植物遺傳資源學(xué)報(bào). 2014(02)
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本文編號(hào)：3571505