植物病毒病由于嚴重影響作物正常生長發(fā)育,發(fā)病后又難以防治,造成巨大經(jīng)濟損失,如何有效防治病毒病一直是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要問題。病毒在侵染寄主植物后,需利用寄主組分,進行復制和移動,因此如何抑制其復制與移動是防治植物病毒病的兩個重要環(huán)節(jié)。植物蛋白酶抑制子（Plant Protease Inhibitor,PPI）是植物重要的防御組分,調(diào)控植物對病、蟲與草等的抗性,但PPI對病毒的抗性研究還相對較少。NbSIPI6是一個被脅迫誘導表達的大豆胰蛋白酶抑制子家族成員,實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)煙草NbSIPI6可抑制PVX病毒的長距離移動,增強本氏煙對PVX的抗性。本實驗想進一步探究NbSIPI6是否拮抗PVY,以此豐富PPI類基因?qū)共《镜恼J識。本實驗利用NbSIPI6融合GFP的轉基因材料,分析NbSIPI6本氏煙對PVY病毒的抗性,并為亞細胞定位和后續(xù)免疫沉淀提供基礎。此外,分析了NbSIPI6響應病毒與水楊酸（Salicylic acid,SA）的表達模式以及NbSIPI6對病毒基因沉默抑制子活性的影響,為探索蛋白酶抑制子在抗病毒中的相關作用機制提供依據(jù)。主要研究結果如下:1.構建NbSIPI6... 

【文章來源】：浙江師范大學浙江省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

NbSIPI6-GFP-1300與NbSIPI6m-GFP-1300載體PCR驗證及酶切驗證M:DNAMarker;1-2:NbSIPI6PCR產(chǎn)物；3-4:NbSIPI6mPCR產(chǎn)物;5:NbSIPI6酶切產(chǎn)物；

第二章NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300載體構建及本氏煙遺傳轉化28圖2.3NbSIPI6本氏煙遺傳轉化過程1.預培養(yǎng)；2.分化；3.生根；4.移栽Fig.2.3TheprocessofAgrobacteriummediatedN.benthamianatransformation1:preconditioning;2:differentiation;3:rooting;4:transplanting12343.3轉基因煙草植株鑒定利用農(nóng)桿菌介導的葉盤法將NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300載體轉入本氏煙，經(jīng)潮霉素(25mg/L)篩選后，獲得16個獨立株系(表2.2)。表2.2轉基因煙草植株統(tǒng)計由于轉基因植株存在假陽性可能，因此需對抗性植株進行鑒定。以轉基因基因組為模板用GFP引物進行PCR檢測，結果在兩種基因型的總計10個轉基因植株上能擴增出700bp左右目的條帶，初步證明目的基因已經(jīng)整合在本氏煙染色體上(表2.2、圖2.4)。獲得植株統(tǒng)計潮霉素篩選獲得T0代轉基因植株數(shù)（株）PCR獲得T0代轉基因植株數(shù)（株）獲得T0代陽性植株數(shù)（株）NbSIPI6超表達533NbSIPI6m超表達1177

第二章NbSIPI6-GFP-1300、NbSIPI6m-GFP-1300載體構建及本氏煙遺傳轉化29M1234567891011121314151617圖2.4轉基因植株的PCR檢測圖M：DNAMarker2000；1-5：NbSIPI6超表達株系；6-16：NbSIPI6超表達突變株系；17：陰性對照；Fig.2.4Detectingofover-expressionlinesbyPCRM:2kbDNAMarker;1-5:PCRproductsofover-expressionNbSIPI6lines;6-16:PCRproductsofover-expressionNbSIPI6mlines;17:wildtype3.4實時定量PCR分析NbSIPI6的表達選取經(jīng)PCR鑒定的超表達NbSIPI6和NbSIPI6m陽性株系，通過實時定量PCR分析靶標基因NbSIPI6的表達，結果如圖2.5所示，陽性株系NbSIPI6表達量與野生型Nb相比有了明顯提高，在T0代顯示有極顯著差異，進一步驗證了超表達NbSIPI6株系和超表達NbSIPI6m株系是陽性株系，從陽性株系中分別挑取三個株系，分別為NbSIPI6-GFP-1300-2、NbSIPI6-GFP-1300-4、NbSIPI6-GFP-1300-5和NbSIPI6m-GFP-1300-5、NbSIPI6m-GFP-1300-8、NbSIPI6m-GFP-1300-11。圖2.5轉基因株系中靶基因的表達Fig.2.5Expressionleveloftargetgeneintransgeniclinesandwildtype

【參考文獻】：
期刊論文
[1]植物病原菌效應因子的毒性功能研究進展[J]. 李金玥.  科教導刊(下旬). 2016(04)
[2]植物抗病毒分子機制[J]. 錢禮超,劉玉樂.  中國科學:生命科學. 2014(10)
[3]植物抗病毒分子機制的研究進展[J]. 孔君,杜智欣,朱水芳,魯潔.  生物技術通報. 2012(11)
[4]植物病毒適應性機制研究進展[J]. 仵發(fā)靜,劉雅婷,李晶,鄭元仙,陳雪嬌,徐燁,智龍.  生物技術通報. 2012(10)
[5]煙草對蝕紋病毒和馬鈴薯Y病毒的抗病性鑒定[J]. 黃婷,袁治禮,成巨龍,吳云鋒,武占敏,代錦.  西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版). 2012(06)
[6]植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位研究進展[J]. 邢浩然,劉麗娟,劉國振.  華北農(nóng)學報. 2006(S2)

碩士論文
[1]堿蓬脫水素蛋白（SsDHN）的亞細胞定位及功能研究[D]. 馬寶月.沈陽農(nóng)業(yè)大學 2019
[2]輔助成分蛋白酶和柱狀內(nèi)含體蛋白在馬鈴薯Y病毒病癥狀形成過程中的作用機制[D]. 欒雅夢.山東農(nóng)業(yè)大學 2019



本文編號：3542759