酰基-�；d體蛋白（acyl-acyl carrier protein,acyl-ACP）作為酰基供體,在脂肪酸、聚酮等天然產(chǎn)物合成途徑中具有重要作用.目前,常以�；�-輔酶A（acyl-CoA）來代替尚未商品化的acyl-ACP進(jìn)行相關(guān)酶的體外活性研究.由于底物蛋白acyl-ACP的ACP部分與相關(guān)酶發(fā)生相互作用,影響酶的催化特性,這種替代無法真實認(rèn)識相關(guān)酶的�；D(zhuǎn)移特性.本文以大腸桿菌pET-28a（+）-ACP為模板,構(gòu)建12株單點(diǎn)突變體,表達(dá)純化出相應(yīng)holoACP,并進(jìn)一步合成C16:0-ACP和C18:1-ACP.高效液相色譜的結(jié)果表明,ACP單點(diǎn)突變會影響acyl-ACP整體的性質(zhì),其中T40殘基的改變對acyl-ACP的疏水性、紫外吸收響應(yīng)和穩(wěn)定性均產(chǎn)生了顯著影響.ACP突變體的性質(zhì)表征為acyl-ACP與相關(guān)酶的互作機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ). 

【文章來源】：北京理工大學(xué)學(xué)報. 2020,40(08)北大核心EICSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

不同物種來源的ACP序列同源性比較

通過SDS-PAGE分析12株holo-ACP突變體（圖2），除I63R出現(xiàn)3個條帶外，其余11株holoACP突變體均為單一條帶，該條帶出現(xiàn)在20kDa處，但holo-ACP的相對分子質(zhì)量為11kDa，這是由于大腸桿菌ACP富含酸性陰離子氨基酸殘基-天冬氨酸和谷氨酸，二者所占比例近50%，使得holo-ACP在SDS-PAGE中的遷移特征與常規(guī)蛋白質(zhì)有所不同，這與文獻(xiàn)[16]一致．可見，除I63R外的11株holo-ACP突變體均純化成功（I63R的holoACP不再繼續(xù)合成acyl-ACP),T64N的條帶位置在其余10株突變體條帶下方，與野生株（WT）有所不同，上述10株突變體的電泳遷移性質(zhì)與WT類似．由表4可知，holo-ACP突變體表達(dá)過程中，先表達(dá)的apo-ACP進(jìn)一步發(fā)生后修飾反應(yīng)，生成holoACP,apo-ACP沒有完全反應(yīng)生成holo-ACP．除I63R的holo-ACP純度只有49%外，WT和其余11株突變體的holo-ACP純度在84%～99%之間．12株holo-ACP突變體中，I63R的蛋白獲得量最低，為5.1mg/L,T40I,L47F,I55F和A60P與WT的蛋白獲得量在同一水平，均在10mg/L以上，其余7株holo-ACP突變體的蛋白獲得量在7～9mg/L之間．

其次，本文比較了各C16:0-ACP和C18:1-ACP突變體在HPLC中檢測信號的單位峰面積所代表的物質(zhì)的量（fmol/mAU）的差異（圖3），以此來表征其在紫外吸收響應(yīng)方面的性質(zhì)差異，fmol/mAU越小，表明該蛋白的紫外吸收響應(yīng)越強(qiáng)．由圖3可知，單位點(diǎn)突變使大部分C16:0-ACP和C18:1-ACP突變體的紫外吸收響應(yīng)增強(qiáng)，其中與WT相比，C16:0-ACP突變體在210nm處的紫外吸收響應(yīng)差異較大的為T40L和A60P,C16:0-ACP的fmol/mAU分別只有WT的0.4和0.3倍，其余10株突變體與WT相近；對于C18:1-ACP，除Q15D和V30L外，其余10株突變體的紫外吸收響應(yīng)均顯著高于WT，特別是T40I,T40L和I55F，其C18:1-ACP的fmol/mAU分別只有WT的0.2,0.5和0.5倍．因此，T40氨基酸殘基也使ACP的紫外吸收發(fā)生了明顯的變化．最后，對acyl-ACP合成產(chǎn)物中C16:0-ACP和C18:1-ACP的純度及其穩(wěn)定性進(jìn)行了評價．由圖4可知，WT和大多突變體的C16:0-ACP純度低于相應(yīng)的C18:1-ACP純度，表明ACP的單點(diǎn)突變對C16:0-ACP穩(wěn)定性的影響更大．在11株ACP突變體中，C16:0-ACP和C18:1-ACP與WT之間純度差異較大的為T40I,L47F,T53F和I55F，這4株突變體的C16:0-ACP純度均在60%以下，C18:1-ACP純度均在75%以下；其余7株突變體的純度均等同于或高于WT．由表6可知，上述4株C16:0-ACP突變體經(jīng)-80℃凍融后，其holo-ACP比例均提高至20%以上，相應(yīng)的C18:1-ACP突變體經(jīng)凍融后的holo-ACP比例提高至5%～10%之間，WT和其余7株突變體的holo-ACP比例變化不大．這些結(jié)果表明上述4株突變體的acyl-ACP易水解，性質(zhì)相對不穩(wěn)定．此外，上述4株holo-ACP突變體合成acyl-ACP后，所含apo-ACP比例會明顯增大（表4和圖4），這可能是在30℃合成反應(yīng)期間ACP上Ser36的羥基與4’-PPT磷酸基之間的磷酯鍵水解造成的．可見，ACP的單點(diǎn)突變T40I,L47F,T53F和I55F會使acyl-ACP合成反應(yīng)體系的不穩(wěn)定性提高，還會影響其已合成C16:0-ACP和C18:1-ACP的水解，表明這些氨基酸殘基在維持ACP的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)穩(wěn)定方面具有重要作用．根據(jù)ACP氨基酸位點(diǎn)的分布信息，T40和L47位于α2螺旋，T53和I55位于L2.Masoudi等研究[9]表明，ACP可通過調(diào)節(jié)α2螺旋、L2和α3螺旋的位置來控制其疏水空腔大小，以容納不同鏈長的�；�，導(dǎo)致acyl-ACP整體構(gòu)象發(fā)生改變．因此，本研究進(jìn)一步表明了氨基酸殘基T40、L47、T53和I55在維持ACP構(gòu)象穩(wěn)定中發(fā)揮的重要作用．

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Acyl-ACPs的規(guī)�；铣蒣J]. 丁威,馮延賓,曹旭鵬,薛松.  中國生物工程雜志. 2018(04)



本文編號：3518137