煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種重要的經(jīng)濟作物,在我國種植范圍較廣。煙草品種是影響煙葉產(chǎn)量和品質的主要因素。目前我國對煙草品種的選育仍停留在以表型選擇為主的傳統(tǒng)育種模式,這種經(jīng)驗育種方式不僅周期長而且品種改良進度緩慢,難以滿足我國的經(jīng)濟發(fā)展需求。CRISPR/Cas9技術是繼鋅指核酸酶（ZFNs）、轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）技術之后的一種新的基因組編輯技術,它具有方便、高效、周期短以及載體結構簡單等優(yōu)點,這為改良品種以及提高煙葉品質提供了一條簡單有效的基因突變技術手段。為快速獲得定向突變材料和提高煙草育種效率,因此,本研究應用CRISPR/Cas9技術構建對煙草CYP71D16基因進行定向突變的重組載體,利用該載體遺傳轉化煙草K326,采用多種方法對轉化株進行篩選及突變鑒定,構建并優(yōu)化了煙草CRISPR/Cas9基因編輯技術體系,獲得了定向突變煙草CYP71D16基因的突變株。主要研究結果如下:1.CRISPR/Cas9重組載體構建:通過對煙草CYP71D16基因序列分析,在外顯子上選擇符合要求的靶點（分別記作SG39、SG38）,將靶點與CRISP... 

【文章來源】：貴州大學貴州省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本結構

圖 2-1 農桿菌培養(yǎng)的 6 種平板劃線方法Fig. 2-1 Six plate streaking methods in Agrobacterium tumefaciens culture植體侵染及共培養(yǎng)盤轉化法進行外植體侵染及共培養(yǎng)。首先，用 10 μl 的槍頭挑放入 5 ml YEP 液體培養(yǎng)基，200 rpm，28℃條件下振蕩-0.7，將振蕩好的菌液轉移至 50 ml 離心管中，于 4℃，6000 rp min，收集菌體。然后，取無菌煙草植物葉片，洗滌干凈后先用 7 s，接著用 0.1%升汞消毒 7 min，再用無菌水沖洗 3-5 次，切成約備用（注意去掉邊緣的葉片）。最后，將收集到的菌體用 MS 將切好的葉片放入重懸菌液中，侵染 6 min，用吸水紙蘸干侵緊密排列于共培養(yǎng)基上，置于 25℃光照下培養(yǎng)。

貴州大學 2019 屆碩士研究生畢業(yè)論文GGGTTGTTATTAGTTCTCCT，記作 SG39。而第二個靶點不需要改變堿基，從而記作 SG38。CRISPR/Cas9 重組載體的質粒圖譜如圖 3-1 。兩種載體均采用加強型CaMV35 啟動子高效表達 Cas9 蛋白，同時采用 CaMV35S 啟動子高效表達潮霉素抗性基因。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術定點敲除煙草多酚氧化酶基因NtPPO1[J]. 姚恒,楊大海,白戈,謝賀.  生物技術通報. 2018(11)
[2]基因編輯新技術最新進展[J]. 張夢娜,柯麗萍,孫玉強.  中國細胞生物學學報. 2018(12)
[3]Micro-Tom番茄轉基因植株再生體系的優(yōu)化[J]. 邱實,張文舉,許馥慧,鄧志瑞.  上海大學學報(自然科學版). 2018(02)
[4]CRISPR/Cas9定點編輯水稻LOCOs05g31750基因位點及靶修飾位點遺傳穩(wěn)定性研究[J]. 沈春修,卻志群,劉瑩,廖錦風.  核農學報. 2018(06)
[5]利用CRISPR/Cas9技術的煙草NtLS基因敲除分析[J]. 王姍姍,楊軍,王中,林福呈,潘婷,武明珠,張劍鋒,曹培健,謝小東.  煙草科技. 2018(02)
[6]內質網(wǎng)應激因子NAC089突變體的創(chuàng)建及其對病毒侵染脅迫的響應[J]. 焦裕冰,秦元霞,何青云,李方方,申莉莉,楊金廣,吳元華.  植物病理學報. 2018(04)
[7]NAA與6-BA對黑金絲柚木組織培養(yǎng)的影響[J]. 李學東,華帥,劉長安.  亞熱帶植物科學. 2017(04)
[8]NAA、IAA和IBA對紅瑞木扦插生根的影響[J]. 劉義,胡大志.  中國林副特產(chǎn). 2017(05)
[9]基于CRISPR/Cas9技術的水稻轉錄因子tify1a和tify1b突變體的創(chuàng)建與分析[J]. 黃小貞,曾曉芳,李建容,趙德剛.  農業(yè)生物技術學報. 2017(06)
[10]利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術定向敲除煙草eIF4E-6基因[J]. 潘洪杏,劉俠,萬秀清,喬嬋,宋琳娜,郭兆奎,李若.  分子植物育種. 2017(02)

博士論文
[1]CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導的棉花GhCLA1和GhVP基因編輯的研究[D]. 陳修貴.華中農業(yè)大學 2017

碩士論文
[1]CRISPR/Cas9編輯NtNINJA基因對低溫脅迫下NtJAZ1的表達量的影響[D]. 呂嘉.西南大學 2018
[2]CRISPR/Cas9介導煙草NtBSK3的基因編輯及NtBSK家族生物學效應分析[D]. 鄭賽.西南大學 2018
[3]CRISPR/Cas9技術編輯普通煙草NtBRI1基因及其生物學效應研究[D]. 周雪.西南大學 2018
[4]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對本氏煙草基因編輯的基礎研究[D]. 劉亞娟.內蒙古大學 2017
[5]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術創(chuàng)造早熟香味水稻[D]. 周文甲.中國科學院大學(中國科學院東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所) 2017
[6]煙堿去甲基化酶基因的敲除與煙草低害素材創(chuàng)制[D]. 陳曉樂.西南大學 2017
[7]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點敲除楊樹和煙草PDS基因的研究[D]. 李媛.安徽農業(yè)大學 2016
[8]利用CRISPR/Cas9技術定向突變水稻光溫敏核不育基因PTGMS2-1的研究[D]. 吳云花.江西農業(yè)大學 2016
[9]栽培煙草原生質體培養(yǎng)再生植株的研究和煙草抗病相關基因NtEIF4E與NtTOM3的敲除和鑒定[D]. 熊海軍.西南大學 2016
[10]病毒介導CRISPR/Cas9煙草基因編輯系統(tǒng)的研究[D]. 宗淵.青海師范大學 2016



本文編號：3509923