發(fā)布時間：2021-11-21 17:24

　　煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物,在我國種植范圍較廣。煙草品種是影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。目前我國對煙草品種的選育仍停留在以表型選擇為主的傳統(tǒng)育種模式,這種經(jīng)驗育種方式不僅周期長而且品種改良進(jìn)度緩慢,難以滿足我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展需求。CRISPR/Cas9技術(shù)是繼鋅指核酸酶（ZFNs）、轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）技術(shù)之后的一種新的基因組編輯技術(shù),它具有方便、高效、周期短以及載體結(jié)構(gòu)簡單等優(yōu)點,這為改良品種以及提高煙葉品質(zhì)提供了一條簡單有效的基因突變技術(shù)手段。為快速獲得定向突變材料和提高煙草育種效率,因此,本研究應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建對煙草CYP71D16基因進(jìn)行定向突變的重組載體,利用該載體遺傳轉(zhuǎn)化煙草K326,采用多種方法對轉(zhuǎn)化株進(jìn)行篩選及突變鑒定,構(gòu)建并優(yōu)化了煙草CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系,獲得了定向突變煙草CYP71D16基因的突變株。主要研究結(jié)果如下:1.CRISPR/Cas9重組載體構(gòu)建:通過對煙草CYP71D16基因序列分析,在外顯子上選擇符合要求的靶點（分別記作SG39、SG38）,將靶點與CRISP... 

【文章來源】：貴州大學(xué)貴州省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)

圖 2-1 農(nóng)桿菌培養(yǎng)的 6 種平板劃線方法Fig. 2-1 Six plate streaking methods in Agrobacterium tumefaciens culture植體侵染及共培養(yǎng)盤轉(zhuǎn)化法進(jìn)行外植體侵染及共培養(yǎng)。首先，用 10 μl 的槍頭挑放入 5 ml YEP 液體培養(yǎng)基，200 rpm，28℃條件下振蕩-0.7，將振蕩好的菌液轉(zhuǎn)移至 50 ml 離心管中，于 4℃，6000 rp min，收集菌體。然后，取無菌煙草植物葉片，洗滌干凈后先用 7 s，接著用 0.1%升汞消毒 7 min，再用無菌水沖洗 3-5 次，切成約備用（注意去掉邊緣的葉片）。最后，將收集到的菌體用 MS 將切好的葉片放入重懸菌液中，侵染 6 min，用吸水紙蘸干侵緊密排列于共培養(yǎng)基上，置于 25℃光照下培養(yǎng)。

貴州大學(xué) 2019 屆碩士研究生畢業(yè)論文GGGTTGTTATTAGTTCTCCT，記作 SG39。而第二個靶點不需要改變堿基，從而記作 SG38。CRISPR/Cas9 重組載體的質(zhì)粒圖譜如圖 3-1 。兩種載體均采用加強(qiáng)型CaMV35 啟動子高效表達(dá) Cas9 蛋白，同時采用 CaMV35S 啟動子高效表達(dá)潮霉素抗性基因。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
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[2]CRISPR/Cas9介導(dǎo)煙草NtBSK3的基因編輯及NtBSK家族生物學(xué)效應(yīng)分析[D]. 鄭賽.西南大學(xué) 2018
[3]CRISPR/Cas9技術(shù)編輯普通煙草NtBRI1基因及其生物學(xué)效應(yīng)研究[D]. 周雪.西南大學(xué) 2018
[4]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對本氏煙草基因編輯的基礎(chǔ)研究[D]. 劉亞娟.內(nèi)蒙古大學(xué) 2017
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[7]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點敲除楊樹和煙草PDS基因的研究[D]. 李媛.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[8]利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向突變水稻光溫敏核不育基因PTGMS2-1的研究[D]. 吳云花.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[9]栽培煙草原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株的研究和煙草抗病相關(guān)基因NtEIF4E與NtTOM3的敲除和鑒定[D]. 熊海軍.西南大學(xué) 2016
[10]病毒介導(dǎo)CRISPR/Cas9煙草基因編輯系統(tǒng)的研究[D]. 宗淵.青海師范大學(xué) 2016



本文編號：3509923