[目的]介紹一種PCR產物直接進行"TA"克隆的高保真PCR法,減少高保真PCR產物"TA"克隆的中間步驟。[方法]Trizol法提取人肝癌細胞SMMC-7721總RNA,并將mRNA反轉錄成cDNA。以cDNA為模板,聯(lián)合不同特性的Taq DNA聚合酶擴增PKC基因的蛋白編碼區(qū)。PCR產物經純化后進行"TA"克隆、細菌轉化、篩選培養(yǎng)、質粒抽提、酶切鑒定和測序鑒定等。[結果]高保真DNA聚合酶擴增的PCR產物未發(fā)現(xiàn)DNA突變,但不能直接進行"TA"克隆。Taq DNA聚合酶擴增的產物可直接進行"TA"克隆,但其內部存在多個突變位點,保真性明顯不足。聯(lián)合使用高保真DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶（雙酶聯(lián)用）擴增的PCR產物可直接進行"TA"克隆,且DNA測序未發(fā)現(xiàn)突變。[結論]雙酶聯(lián)用PCR可以獲得高保真PCR產物,并直接進行"TA"克隆。 

【文章來源】：安徽農業(yè)科學. 2020,48(05)

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【部分圖文】：

圖1 雙酶聯(lián)用PCR擴增靶基因PKCε的蛋白編碼區(qū)

PCR產物的“TA”克隆

不同來源的單克隆菌落經擴大培養(yǎng)、質粒抽提和Xho Ⅰ酶切鑒定后, 發(fā)現(xiàn)T載體中所含有的靶序列長度均一致(圖3)。對這些質粒進行DNA測序,測序結果顯示用LA Taq? DNA聚合酶擴增的2.2 kb的DNA產物中存在多處點突變和缺失突變,其中一株克隆菌落中的靶DNA有6處點突變;而用PrimeSTAR? G×L DNA聚合酶和雙酶聯(lián)用擴增的PCR產物具有高度保真性,無基因突變。說明雙酶聯(lián)用可以保證PCR擴增產物的高保真性。3 討論

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3501273