天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵抗病原體感染的第一道防線。在長期與病原體的斗爭中,天然免疫系統(tǒng)進(jìn)化出了一系列模式識別受體,能夠識別各種病原體特有的“異己”信號,迅速地激活機(jī)體的天然免疫反應(yīng)。cGAS（Cyclic GMPAMP synthase）作為一種關(guān)鍵的模式識別受體,能夠識別一種特殊的“異己”信號——DNA。在正常情況下,DNA被嚴(yán)格地限制在細(xì)胞核或線粒體這樣的結(jié)構(gòu)內(nèi)與胞質(zhì)隔離,只有當(dāng)病原體感染或細(xì)胞損傷時(shí),DNA才會出現(xiàn)在胞質(zhì)中,進(jìn)而被細(xì)胞視為“異己”信號并啟動(dòng)免疫應(yīng)答。cGAS在識別并結(jié)合胞漿DNA后會發(fā)生構(gòu)象改變,并迅速催化ATP和GTP合成環(huán)二核苷酸cGAMP（Cyclic GMP-AMP）。cGAMP作為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使,進(jìn)而結(jié)合并激活接頭蛋白質(zhì)STING及下游信號通路,引起轉(zhuǎn)錄因子IRF3活化,啟動(dòng)Ⅰ型干擾素表達(dá),幫助宿主進(jìn)行免疫防御。cGAS能夠識別不同病原體來源DNA,其對DNA的結(jié)合不依賴特征性序列。這樣一種廣泛的識別作用也導(dǎo)致cGAS能夠識別自身的DNA,cGAS的異常激活參與了包括自身免疫病在內(nèi)的多種疾病發(fā)生。因此,對cGAS功能的精確調(diào)控能夠幫助機(jī)體在維持穩(wěn)態(tài)的同時(shí)... 

【文章來源】：軍事科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

1質(zhì)譜鑒定得到與cGAS有潛在相互作用的高分值候選蛋白質(zhì)

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文第41頁2.1.2.G3BP1對DNA激活的I型干擾素生成具有重要促進(jìn)作用為了評價(jià)G3BP1對cGAS信號通路的調(diào)控作用，我們首先利用CRISPR／Cas9技術(shù)在U937細(xì)胞中敲除了G3BP1，并分別檢測了野生型（WT）以及G3BP1敲除（G3BP1–/–）的U937細(xì)胞中G3BP1的敲除效果以及cGAS信號通路的完整性（圖2.1.2a，右），我們發(fā)現(xiàn)敲除G3BP1不影響cGAS信號通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)。我們進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染DNA模擬外源DNA侵入細(xì)胞的過程。我們用2g/ml的HT-DNA刺激細(xì)胞，12小時(shí)后通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測I型干擾素IFN-的釋放。結(jié)果顯示，與WT細(xì)胞相比，G3BP1敲除的U937細(xì)胞在HT-DNA刺激下產(chǎn)生的IFN-明顯減少（圖2.1.2a，左）。ELISA檢測數(shù)值以均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，***P<0.001，雙尾t檢驗(yàn)，N.D.（non-detected）表示未檢測到。-actin為內(nèi)參蛋白質(zhì)。圖2.1.2aU937細(xì)胞中敲除G3BP1，顯著抑制HT-DNA誘導(dǎo)的IFN-釋放我們又嘗試以不同濃度的HT-DNA分別刺激兩種細(xì)胞，2小時(shí)后利用Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，并通過定量PCR（qPCR）分析I型干擾素基因IFNB的轉(zhuǎn)錄變化（圖2.1.2b）。qPCR檢測數(shù)值以均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，**P<0.01，***P<0.001，雙尾t檢驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)與ELISA結(jié)果一致，敲除G3BP1顯著抑制HT-DNA導(dǎo)致的IFNB轉(zhuǎn)錄。盡管隨著HT-DNA刺激濃度增加（至飽和程度），敲除G3BP1帶來的抑制效應(yīng)在一定程度上有所補(bǔ)償，但其激活程度仍明顯弱于同樣刺激濃度下WT組IFNB的轉(zhuǎn)錄水平。圖2.1.2bU937細(xì)胞中敲除G3BP1，顯著抑制不同濃度HT-DNA誘導(dǎo)的IFNB轉(zhuǎn)錄

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文第41頁2.1.2.G3BP1對DNA激活的I型干擾素生成具有重要促進(jìn)作用為了評價(jià)G3BP1對cGAS信號通路的調(diào)控作用，我們首先利用CRISPR／Cas9技術(shù)在U937細(xì)胞中敲除了G3BP1，并分別檢測了野生型（WT）以及G3BP1敲除（G3BP1–/–）的U937細(xì)胞中G3BP1的敲除效果以及cGAS信號通路的完整性（圖2.1.2a，右），我們發(fā)現(xiàn)敲除G3BP1不影響cGAS信號通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)。我們進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)染DNA模擬外源DNA侵入細(xì)胞的過程。我們用2g/ml的HT-DNA刺激細(xì)胞，12小時(shí)后通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測I型干擾素IFN-的釋放。結(jié)果顯示，與WT細(xì)胞相比，G3BP1敲除的U937細(xì)胞在HT-DNA刺激下產(chǎn)生的IFN-明顯減少（圖2.1.2a，左）。ELISA檢測數(shù)值以均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，***P<0.001，雙尾t檢驗(yàn)，N.D.（non-detected）表示未檢測到。-actin為內(nèi)參蛋白質(zhì)。圖2.1.2aU937細(xì)胞中敲除G3BP1，顯著抑制HT-DNA誘導(dǎo)的IFN-釋放我們又嘗試以不同濃度的HT-DNA分別刺激兩種細(xì)胞，2小時(shí)后利用Trizol裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，并通過定量PCR（qPCR）分析I型干擾素基因IFNB的轉(zhuǎn)錄變化（圖2.1.2b）。qPCR檢測數(shù)值以均值±均值標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，**P<0.01，***P<0.001，雙尾t檢驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)與ELISA結(jié)果一致，敲除G3BP1顯著抑制HT-DNA導(dǎo)致的IFNB轉(zhuǎn)錄。盡管隨著HT-DNA刺激濃度增加（至飽和程度），敲除G3BP1帶來的抑制效應(yīng)在一定程度上有所補(bǔ)償，但其激活程度仍明顯弱于同樣刺激濃度下WT組IFNB的轉(zhuǎn)錄水平。圖2.1.2bU937細(xì)胞中敲除G3BP1，顯著抑制不同濃度HT-DNA誘導(dǎo)的IFNB轉(zhuǎn)錄


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