生物法制備蜂毒肽是實(shí)現(xiàn)大量制備蜂毒肽的關(guān)鍵技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)蜂毒肽的高效表達(dá),通過(guò)化學(xué)法合成含信號(hào)肽、前導(dǎo)肽和成熟肽的蜂毒肽基因promet和蜂毒肽成熟肽基因met,與麥芽糖結(jié)合蛋白基因mbp連接,克隆到載體pET15-b,構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-MBP-MET和pET-MBPproMET。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21（DE3）,以0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),30℃下過(guò)夜誘導(dǎo),融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET在大腸桿菌中以可溶性形式高效表達(dá)。兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)經(jīng)Ni柱和Dextrin Sepharose HP兩步親和純化,得到了純度達(dá)90%以上的融合蛋白MBP-MET、MBP-proMET,培養(yǎng)1 L大腸桿菌菌液能制備約20 mg純蛋白質(zhì)。通過(guò)牛津杯抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),MBP-MET、MBP-proMET能明顯抑制細(xì)菌生長(zhǎng),產(chǎn)生明顯的抑菌圈,MBP-MET和MBP-proMET最低抑菌濃度（MIC）分別為100μg/mL和140μg/mL。本研究首次實(shí)現(xiàn)了蜂毒肽的高效表達(dá),并進(jìn)行了抑菌功能驗(yàn)證,為生物法制備蜂毒肽提供了高效、安全的合成途徑。 

【文章來(lái)源】：食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2020,39(08)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

標(biāo)簽融合的p ET-MBP-MET、p ET-MBP-pro MET質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

蜂毒肽met、前蜂毒肽promet與麥芽糖結(jié)合蛋白mbp基因經(jīng)PCR擴(kuò)增后分別獲得126、252、1 152 bp的特異性片段，見(jiàn)圖2。重疊延伸后得到MBP-MET和MBP-pro MET片段。將PCR產(chǎn)物連接至克隆載體p MD19-T，測(cè)序結(jié)果表明MBP-MET基因片段正確插入p MD19-T載體。2.2 重組表達(dá)載體p ET-MBP-MET、p ET-MBP-pro MET構(gòu)建

將表達(dá)質(zhì)粒p ET-MBP-MET轉(zhuǎn)入E.coli BL21，挑取單菌落培養(yǎng)，在0.1 mmol/L IPTG、30℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)，收集細(xì)胞，每100 m L培養(yǎng)基能收集0.6 g濕菌。重懸并超聲破碎后離心收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE驗(yàn)證。結(jié)果如圖3所示，上清液可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量46 200（見(jiàn)圖3(a））和50 800（見(jiàn)圖3 (b））的條帶，分別與融合蛋白質(zhì)MBP-MET和MBP-pro MET理論大小一致，且上清液中目標(biāo)條帶濃度高于沉淀。經(jīng)凝膠電泳成像儀分析，上清液的目標(biāo)條帶占全細(xì)胞總量的15%，說(shuō)明融合蛋白質(zhì)MBP-MET在重組大腸桿菌中主要以可溶性蛋白質(zhì)的形式表達(dá)。2.4 融合蛋白質(zhì)MBP-MET和MBP-pro MET的純化

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3487371