OsMADS56是水稻中長日照下的開花抑制基因,與擬南芥中同時影響開花時間和花發(fā)育的SOC1同源。為了深入探究OsMADS56基因?qū)λ鹃_花時間的調(diào)控功能,本研究利用反向遺傳學的方法通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對OsMADS56基因設(shè)計了2個特異性敲除靶位點,構(gòu)建了OsMADS56基因敲除載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法成功獲得了野生型粳稻9522背景的轉(zhuǎn)基因苗。鑒定結(jié)果顯示9棵OsMADS56轉(zhuǎn)基因苗中包含了3種純合突變類型,包括第一個外顯子第45號堿基處缺失了一個G堿基、缺失了包含了第一個起始密碼子的100個堿基對以及在第5個外顯子第322號堿基處插入一個A堿基。通過蛋白序列比對分析,發(fā)現(xiàn)這三種類型的突變均造成移碼突變和蛋白翻譯提前終止引起保守結(jié)構(gòu)域的缺失。本研究獲得的水稻OsMADS56基因的三個突變體株系對今后進一步深入研究該基因的功能具有重要意義。 

【文章來源】：分子植物育種. 2020,18(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

OsMADS56基因的系統(tǒng)進化

在選擇的OsMADS56基因的2個單敲除靶位點處分別設(shè)計引物，并將合成的引物退火合成目標片段。然后通過BsaⅠ酶切位點將目標片段連入pBIN-sgR-Cas9-Os載體中，然后將含有目標片段的CH載體連接到pCAMBIA1300載體上。通過PCR鑒定和測序確認載體構(gòu)建成功后，分別命名為pBinOs MADS56-T1、p Bin-OsMADS56-T2。將構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105，再通過PCR鑒定篩選出含有陽性載體的農(nóng)桿菌菌株，并侵染野生型水稻的愈傷組織。通過篩選培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)得到成熟的水稻苗。提取葉片DNA，用鑒定引物(M13F和JD-M56-1R,M13F和JD-M56-2R)(表1)分別鑒定2個靶位點的植株是否攜帶了CRISPR/Cas9載體。用測序引物(JD-M56-1F和JD-M56-1R,JD-M56-2F和JD-M56-2R)(表1)分別對2個靶位點特異性敲除的轉(zhuǎn)基因陽性植株進行PCR擴增，并將擴增片段測序確認靶位點序列變異。特異性鑒定引物擴增的片段長度分別為259 bp，野生型植株不能擴增出目的片段，電泳結(jié)果顯示T0代5株苗為轉(zhuǎn)基因植株pBin-OsMADS56-T1-9522,4株苗為轉(zhuǎn)基因植株pBin-OsMADS56-T2-9522(圖4)。圖3 OsMADS56基因的結(jié)構(gòu)及g RNA靶位點位置

OsMADS56基因的結(jié)構(gòu)及g RNA靶位點位置

【參考文獻】：
期刊論文
[1]OsMADS34與OsMADS56蛋白互作及OsMADS56表達模式分析[J]. 李曉峰,張大兵.  基因組學與應(yīng)用生物學. 2018(04)
[2]利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得水稻OsYUCCA1基因突變體[J]. 何先暢,黃國強,王道洋,常淑偉,張大兵.  基因組學與應(yīng)用生物學. 2017(11)



本文編號：3478495