發(fā)布時(shí)間：2021-11-05 20:54

　　OsMADS56是水稻中長(zhǎng)日照下的開花抑制基因,與擬南芥中同時(shí)影響開花時(shí)間和花發(fā)育的SOC1同源。為了深入探究OsMADS56基因?qū)λ鹃_花時(shí)間的調(diào)控功能,本研究利用反向遺傳學(xué)的方法通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)OsMADS56基因設(shè)計(jì)了2個(gè)特異性敲除靶位點(diǎn),構(gòu)建了OsMADS56基因敲除載體,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法成功獲得了野生型粳稻9522背景的轉(zhuǎn)基因苗。鑒定結(jié)果顯示9棵OsMADS56轉(zhuǎn)基因苗中包含了3種純合突變類型,包括第一個(gè)外顯子第45號(hào)堿基處缺失了一個(gè)G堿基、缺失了包含了第一個(gè)起始密碼子的100個(gè)堿基對(duì)以及在第5個(gè)外顯子第322號(hào)堿基處插入一個(gè)A堿基。通過蛋白序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)這三種類型的突變均造成移碼突變和蛋白翻譯提前終止引起保守結(jié)構(gòu)域的缺失。本研究獲得的水稻OsMADS56基因的三個(gè)突變體株系對(duì)今后進(jìn)一步深入研究該基因的功能具有重要意義。 

【文章來源】：分子植物育種. 2020,18(11)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

OsMADS56基因的系統(tǒng)進(jìn)化

在選擇的OsMADS56基因的2個(gè)單敲除靶位點(diǎn)處分別設(shè)計(jì)引物，并將合成的引物退火合成目標(biāo)片段。然后通過BsaⅠ酶切位點(diǎn)將目標(biāo)片段連入pBIN-sgR-Cas9-Os載體中，然后將含有目標(biāo)片段的CH載體連接到pCAMBIA1300載體上。通過PCR鑒定和測(cè)序確認(rèn)載體構(gòu)建成功后，分別命名為pBinOs MADS56-T1、p Bin-OsMADS56-T2。將構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105，再通過PCR鑒定篩選出含有陽性載體的農(nóng)桿菌菌株，并侵染野生型水稻的愈傷組織。通過篩選培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)得到成熟的水稻苗。提取葉片DNA，用鑒定引物(M13F和JD-M56-1R,M13F和JD-M56-2R)(表1)分別鑒定2個(gè)靶位點(diǎn)的植株是否攜帶了CRISPR/Cas9載體。用測(cè)序引物(JD-M56-1F和JD-M56-1R,JD-M56-2F和JD-M56-2R)(表1)分別對(duì)2個(gè)靶位點(diǎn)特異性敲除的轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增片段測(cè)序確認(rèn)靶位點(diǎn)序列變異。特異性鑒定引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度分別為259 bp，野生型植株不能擴(kuò)增出目的片段，電泳結(jié)果顯示T0代5株苗為轉(zhuǎn)基因植株pBin-OsMADS56-T1-9522,4株苗為轉(zhuǎn)基因植株pBin-OsMADS56-T2-9522(圖4)。圖3 OsMADS56基因的結(jié)構(gòu)及g RNA靶位點(diǎn)位置

OsMADS56基因的結(jié)構(gòu)及g RNA靶位點(diǎn)位置

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]OsMADS34與OsMADS56蛋白互作及OsMADS56表達(dá)模式分析[J]. 李曉峰,張大兵.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2018(04)
[2]利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)獲得水稻OsYUCCA1基因突變體[J]. 何先暢,黃國(guó)強(qiáng),王道洋,常淑偉,張大兵.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2017(11)



本文編號(hào)：3478495