甲羥戊酸途徑（MVA途徑）被引入重組大腸桿菌中,能夠提高重組大腸桿菌中萜類化合物的合成能力。但因重組大腸桿菌中萜類化合物合成途徑中間產(chǎn)物積累,導(dǎo)致細(xì)胞生長和萜類化合物合成受到限制。本研究在穩(wěn)定表達(dá)MVA途徑以及優(yōu)化2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑（MEP途徑）、番茄紅素合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的重組大腸桿菌LYC103中,用質(zhì)粒高表達(dá)MVA途徑和番茄紅素合成途徑關(guān)鍵基因,挖掘該途徑的限速步驟。結(jié)果表明,ispA、crtE、mvaK1、idi和mvaD基因過表達(dá)后,細(xì)胞生長沒有明顯變化,番茄紅素產(chǎn)量依次提高了13.5%、16.5%、17.95%、33.7%和61.1%,說明這幾個基因可能是合成番茄紅素的限速步驟。mvaK1、mvaK2、mvaD三個基因在同一操縱子上,用mRNA穩(wěn)定區(qū)（RNA stabilizing region）進(jìn)行啟動子文庫（mRSL）調(diào)控mvaK1,相當(dāng)于對3個基因同時調(diào)控。用高效基因組編輯技術(shù)（CAGO）對mvaK1基因的mRNA穩(wěn)定區(qū)進(jìn)行啟動子文庫的調(diào)控,得到菌株LYC104。番茄紅素產(chǎn)量與對照菌株LYC103相比增加了2倍,細(xì)胞生長提高了32%。然后,利用CR... 

【文章來源】：生物工程學(xué)報(bào). 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：13 頁

【部分圖文】：

LYC104構(gòu)建流程圖

通過將番茄紅素合成基因過表達(dá)的形式來尋找番茄紅素合成途徑中的限速步驟。以pSC103質(zhì)粒為模板擴(kuò)增大小為5 kb的骨架，以LYC103菌株DNA基因組為模板，將mvaE、mvaS、mvaK1、mvaK2和mvaD基因以及idi、ispA和crtE基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，依次得到片段大小為2 412 bp、1 152 bp、879 bp、954 bp、1 011 bp、1 049 bp、900 bp和919 bp。核酸電泳圖如圖4所示。采用CPEC方法將單個基因連接到中pSC103質(zhì)粒上，然后電轉(zhuǎn)化菌株LYC103，取陽性單克隆用99A-F和擴(kuò)增相應(yīng)基因的下游引物進(jìn)行菌落PCR，驗(yàn)證正確連接質(zhì)粒。將PCR驗(yàn)證正確質(zhì)粒送樣測序，測序正確的質(zhì)粒分別依照表1中的質(zhì)粒名稱進(jìn)行命名。2.2 單基因過表達(dá)對番茄紅素產(chǎn)量的影響

近年來，多個研究組對提高重組大腸桿菌中類胡蘿卜素產(chǎn)量進(jìn)行了研究，主要包括MEP途徑研究[9-13]、中央代謝途徑改造[14-18]、引入MVA途徑增加前體物質(zhì)供應(yīng)[19-23]等幾個方面。通過MVA途徑增加萜類化合物前體物質(zhì)供應(yīng)，提高重組大腸桿菌類胡蘿卜素產(chǎn)量已經(jīng)有較為詳細(xì)研究。Vadali等將MVA途徑基因引入大腸桿菌，增加番茄紅素合成前體物質(zhì)IPP和DMAPP供應(yīng)，番茄紅素產(chǎn)量提高一倍[19]。Yoon等將MVA途徑的后半部分幾個基因引入大腸桿菌中，并通過增加MVA途徑中間產(chǎn)物甲羥戊酸，成功提高番茄紅素產(chǎn)量[20-21]。Anthony等發(fā)現(xiàn)MVA途徑中甲羥戊酸激酶(MK)是一種限速酶[24]，通過改變限速基因啟動子和質(zhì)粒拷貝數(shù)，目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提高了7倍。但是，有研究表明甲羥戊酸途徑酶表達(dá)不平衡可以抑制細(xì)胞生長[5,19]。Pitera等過表達(dá)MVA途徑上游的幾個基因，MVA途徑中間體羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMGCo A)積累，抑制了細(xì)胞生長[5,25]。馮凡等將MVA途徑分成3個代謝元件模塊，并通過調(diào)控元件的表達(dá)來增強(qiáng)模塊功能，從而使異戊二烯的產(chǎn)量得到提高[26]。Ye等將MVA途徑分成兩個模塊在染色體上進(jìn)行整合，并對兩個模塊建庫調(diào)控，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了51%[23]。Wei等將MVA途徑分成上下游兩個模塊基于染色體多位點(diǎn)整合策略，提高大腸桿菌合成番茄紅素的產(chǎn)量[27]。Ye等構(gòu)建MVA途徑的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶/HMG-CoA還原酶基因(mvaE)和mvaS基因等5個基因的RBS文庫，根據(jù)菌株顏色，篩選到使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高的質(zhì)粒[22]。然后將得到協(xié)調(diào)表達(dá)的MVA途徑基因整合到產(chǎn)番茄紅素的重組大腸桿菌的染色體上，使番茄紅素產(chǎn)量提高了1.19倍[5]。本研究對所得的LYC102菌株進(jìn)行調(diào)控得到LYC103菌株[5,28]。LYC103菌株中MEP途徑經(jīng)過精確調(diào)控[13,18,29]，并且在染色體上含有完整的MVA途徑基因[5,28]。MVA途徑基因雖然經(jīng)過RBS建庫協(xié)調(diào)表達(dá)，但是可能因?yàn)楸揪晔菃慰截惖娜旧w表達(dá)，而Ye文獻(xiàn)[22]中是多拷貝的質(zhì)粒表達(dá)，并且本菌株MVA途徑操縱子又經(jīng)過了更換啟動子的改造，所以MVA途徑可能重新出現(xiàn)限速步驟。另外，在LYC103中添加了MVA途徑，進(jìn)一步增加了IPP/DMAPP的供應(yīng)，下游也可能成為限速步驟，因此，確保整合MVA途徑的菌株中前體物質(zhì)的平衡供給，同時尋找并解除下游合成途徑中的限速步驟。本研究首次在染色體整合完整MVA途徑基因的基礎(chǔ)上，將MVA途徑中的5個基因進(jìn)行研究，本方法優(yōu)于對MVA途徑5個基因同時進(jìn)行研究。另外對番茄紅素合成途徑下游的異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(idi)、香葉醇轉(zhuǎn)移酶(ispA)、GGPP合成酶基因(crtE)以單基因、多基因組合等方法在重組大腸桿菌中過量表達(dá)，從而尋找新的限速步驟，研究細(xì)胞生長和番茄紅素產(chǎn)量的變化，并進(jìn)一步提高番茄紅素產(chǎn)量。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]穩(wěn)定表達(dá)MVA途徑基因提高番茄紅素產(chǎn)量[J]. 李貞霞,陳倩倩,唐金磊,李清艷,張學(xué)禮.  生物工程學(xué)報(bào). 2019(03)
[2]代謝工程改造甘油代謝途徑提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量[J]. 董悅,胡坤樂,李興林,李清艷,張學(xué)禮.  生物工程學(xué)報(bào). 2017(02)
[3]提高大腸桿菌通過MVA途徑合成異戊二烯[J]. 馮凡,許楊,陶勇,劉偉豐,林白雪.  生物工程學(xué)報(bào). 2015(07)
[4]多個調(diào)控元件調(diào)控萜類合成途徑基因表達(dá)提高β-胡蘿卜素的生產(chǎn)[J]. 趙婧,劉怡,李清艷,朱欣娜,張學(xué)禮.  生物工程學(xué)報(bào). 2013(01)

碩士論文
[1]番茄紅素合成基因在大腸桿菌中的調(diào)控研究[D]. 陳倩倩.河南科技學(xué)院 2019



本文編號：3450444