甲羥戊酸途徑（MVA途徑）被引入重組大腸桿菌中,能夠提高重組大腸桿菌中萜類化合物的合成能力。但因重組大腸桿菌中萜類化合物合成途徑中間產(chǎn)物積累,導致細胞生長和萜類化合物合成受到限制。本研究在穩(wěn)定表達MVA途徑以及優(yōu)化2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途徑（MEP途徑）、番茄紅素合成途徑關鍵基因表達的重組大腸桿菌LYC103中,用質(zhì)粒高表達MVA途徑和番茄紅素合成途徑關鍵基因,挖掘該途徑的限速步驟。結(jié)果表明,ispA、crtE、mvaK1、idi和mvaD基因過表達后,細胞生長沒有明顯變化,番茄紅素產(chǎn)量依次提高了13.5%、16.5%、17.95%、33.7%和61.1%,說明這幾個基因可能是合成番茄紅素的限速步驟。mvaK1、mvaK2、mvaD三個基因在同一操縱子上,用mRNA穩(wěn)定區(qū)（RNA stabilizing region）進行啟動子文庫（mRSL）調(diào)控mvaK1,相當于對3個基因同時調(diào)控。用高效基因組編輯技術（CAGO）對mvaK1基因的mRNA穩(wěn)定區(qū)進行啟動子文庫的調(diào)控,得到菌株LYC104。番茄紅素產(chǎn)量與對照菌株LYC103相比增加了2倍,細胞生長提高了32%。然后,利用CR... 

【文章來源】：生物工程學報. 2020,36(01)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：13 頁

【部分圖文】：

LYC104構(gòu)建流程圖

通過將番茄紅素合成基因過表達的形式來尋找番茄紅素合成途徑中的限速步驟。以pSC103質(zhì)粒為模板擴增大小為5 kb的骨架，以LYC103菌株DNA基因組為模板，將mvaE、mvaS、mvaK1、mvaK2和mvaD基因以及idi、ispA和crtE基因進行PCR擴增，依次得到片段大小為2 412 bp、1 152 bp、879 bp、954 bp、1 011 bp、1 049 bp、900 bp和919 bp。核酸電泳圖如圖4所示。采用CPEC方法將單個基因連接到中pSC103質(zhì)粒上，然后電轉(zhuǎn)化菌株LYC103，取陽性單克隆用99A-F和擴增相應基因的下游引物進行菌落PCR，驗證正確連接質(zhì)粒。將PCR驗證正確質(zhì)粒送樣測序，測序正確的質(zhì)粒分別依照表1中的質(zhì)粒名稱進行命名。2.2 單基因過表達對番茄紅素產(chǎn)量的影響

近年來，多個研究組對提高重組大腸桿菌中類胡蘿卜素產(chǎn)量進行了研究，主要包括MEP途徑研究[9-13]、中央代謝途徑改造[14-18]、引入MVA途徑增加前體物質(zhì)供應[19-23]等幾個方面。通過MVA途徑增加萜類化合物前體物質(zhì)供應，提高重組大腸桿菌類胡蘿卜素產(chǎn)量已經(jīng)有較為詳細研究。Vadali等將MVA途徑基因引入大腸桿菌，增加番茄紅素合成前體物質(zhì)IPP和DMAPP供應，番茄紅素產(chǎn)量提高一倍[19]。Yoon等將MVA途徑的后半部分幾個基因引入大腸桿菌中，并通過增加MVA途徑中間產(chǎn)物甲羥戊酸，成功提高番茄紅素產(chǎn)量[20-21]。Anthony等發(fā)現(xiàn)MVA途徑中甲羥戊酸激酶(MK)是一種限速酶[24]，通過改變限速基因啟動子和質(zhì)粒拷貝數(shù)，目標產(chǎn)物產(chǎn)量提高了7倍。但是，有研究表明甲羥戊酸途徑酶表達不平衡可以抑制細胞生長[5,19]。Pitera等過表達MVA途徑上游的幾個基因，MVA途徑中間體羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMGCo A)積累，抑制了細胞生長[5,25]。馮凡等將MVA途徑分成3個代謝元件模塊，并通過調(diào)控元件的表達來增強模塊功能，從而使異戊二烯的產(chǎn)量得到提高[26]。Ye等將MVA途徑分成兩個模塊在染色體上進行整合，并對兩個模塊建庫調(diào)控，β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高了51%[23]。Wei等將MVA途徑分成上下游兩個模塊基于染色體多位點整合策略，提高大腸桿菌合成番茄紅素的產(chǎn)量[27]。Ye等構(gòu)建MVA途徑的乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶/HMG-CoA還原酶基因(mvaE)和mvaS基因等5個基因的RBS文庫，根據(jù)菌株顏色，篩選到使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高的質(zhì)粒[22]。然后將得到協(xié)調(diào)表達的MVA途徑基因整合到產(chǎn)番茄紅素的重組大腸桿菌的染色體上，使番茄紅素產(chǎn)量提高了1.19倍[5]。本研究對所得的LYC102菌株進行調(diào)控得到LYC103菌株[5,28]。LYC103菌株中MEP途徑經(jīng)過精確調(diào)控[13,18,29]，并且在染色體上含有完整的MVA途徑基因[5,28]。MVA途徑基因雖然經(jīng)過RBS建庫協(xié)調(diào)表達，但是可能因為本菌株是單拷貝的染色體表達，而Ye文獻[22]中是多拷貝的質(zhì)粒表達，并且本菌株MVA途徑操縱子又經(jīng)過了更換啟動子的改造，所以MVA途徑可能重新出現(xiàn)限速步驟。另外，在LYC103中添加了MVA途徑，進一步增加了IPP/DMAPP的供應，下游也可能成為限速步驟，因此，確保整合MVA途徑的菌株中前體物質(zhì)的平衡供給，同時尋找并解除下游合成途徑中的限速步驟。本研究首次在染色體整合完整MVA途徑基因的基礎上，將MVA途徑中的5個基因進行研究，本方法優(yōu)于對MVA途徑5個基因同時進行研究。另外對番茄紅素合成途徑下游的異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(idi)、香葉醇轉(zhuǎn)移酶(ispA)、GGPP合成酶基因(crtE)以單基因、多基因組合等方法在重組大腸桿菌中過量表達，從而尋找新的限速步驟，研究細胞生長和番茄紅素產(chǎn)量的變化，并進一步提高番茄紅素產(chǎn)量。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]穩(wěn)定表達MVA途徑基因提高番茄紅素產(chǎn)量[J]. 李貞霞,陳倩倩,唐金磊,李清艷,張學禮.  生物工程學報. 2019(03)
[2]代謝工程改造甘油代謝途徑提高β-胡蘿卜素產(chǎn)量[J]. 董悅,胡坤樂,李興林,李清艷,張學禮.  生物工程學報. 2017(02)
[3]提高大腸桿菌通過MVA途徑合成異戊二烯[J]. 馮凡,許楊,陶勇,劉偉豐,林白雪.  生物工程學報. 2015(07)
[4]多個調(diào)控元件調(diào)控萜類合成途徑基因表達提高β-胡蘿卜素的生產(chǎn)[J]. 趙婧,劉怡,李清艷,朱欣娜,張學禮.  生物工程學報. 2013(01)

碩士論文
[1]番茄紅素合成基因在大腸桿菌中的調(diào)控研究[D]. 陳倩倩.河南科技學院 2019



本文編號：3450444