植物的新陳代謝不僅需要光,還需要水和特定的礦質(zhì)元素滿足生長(zhǎng)和發(fā)育的需求。銅和鐵是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素,在植物體內(nèi)多種生理代謝過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多種金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族參與植物體內(nèi)對(duì)鐵以及銅的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,例如重金屬ATP酶（HMA）蛋白家族以及黃色條紋轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（YSL）家族。銅和鐵既能以離子的形式直接被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn),也可以和金屬螯合物進(jìn)行結(jié)合形成復(fù)合物被金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn),常見(jiàn)的金屬螯合物包括煙酰胺（NA）、植物螯合肽（PC）、脫氧麥根酸（DMA）、谷胱甘肽（GSH）等物質(zhì)。目前對(duì)銅和鐵在植物體內(nèi)的吸收、運(yùn)輸和分配機(jī)制的研究逐漸深入,但是目前對(duì)于銅和鐵的長(zhǎng)距離運(yùn)輸機(jī)制還有許多細(xì)節(jié)仍有待解釋。本課題發(fā)現(xiàn)擬南芥（Arabidopsis thaliana）內(nèi)兩個(gè)可能參與到離子轉(zhuǎn)運(yùn)的基因,并將其分別命名為NAT1和NAT2。NAT1和NAT2同屬于NPF轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族,對(duì)兩者的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)后發(fā)現(xiàn)NAT1和NAT2相似性高達(dá)74.1%。通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)敲除NAT1和NAT2基因,制備篩選獲得nat1、nat2、nat1nat2擬南芥突變體。在之后的培... 

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【部分圖文】：

CRISPR-Cas9技術(shù)制備獲得nat1,nat2單突變體及雙突變體

3結(jié)果與分析23圖3-2nat1、nat2、nat1nat2葉片離子含量變化。取樣在土壤中生長(zhǎng)四周大的Col-0、nat1-77、nat2-53、nat1nat2-53葉片，使用ICP-MS技術(shù)測(cè)定離子含量。圖中的數(shù)據(jù)為突變體與野生型離子含量相比所得數(shù)據(jù)，n=6。Fig3-2Ionomechangesofnat1,nat2,nat1nat2inleaves.TheleavesofCol-0,nat1-77,nat2-53andnat1nat2-53wereculturedinartificialsoilforfourweeksanddeterminedbyICP-MS.Thedataisobtainedbycomparingtheionomeofthemutantwiththewildtype,n=6.3.1.3nat1nat2突變體種子表現(xiàn)出明顯的離子變化為了進(jìn)一步探究nat1nat2離子含量變化，采用ICP-MS技術(shù)測(cè)定了Col-0、nat1-77、nat2-53、nat1nat2-70、nat1nat2-53、nat1nat2-77植株成熟種子中的離子含量。離子組測(cè)定結(jié)果顯示，nat1與nat2單突變體與野生型Col-0種子中鐵、鈷的含量并不存在顯著差異，但nat1nat2雙突變體種子中銅、鐵的含量顯著下降，其中鐵的含量降低了約60%，銅的含量降低了約40%（圖3-3）。nat1nat2種子以及葉片中銅、鈷、鐵離子含量的改變都表明NAT1以及NAT2可能共同參與調(diào)控?cái)M南芥內(nèi)銅、鐵、鈷的穩(wěn)態(tài)。

NAT1及NAT2調(diào)控?cái)M南芥銅及鐵穩(wěn)態(tài)作用機(jī)制研究24圖3-3Col-0、nat1、nat2、nat1nat2植株種子離子含量變化。取樣土壤種植的Col-0、nat1-77、nat2-53、nat1nat2-53植株成熟種子，使用ICP-MS技術(shù)測(cè)定銅、鐵、鈷的離子含量。小寫(xiě)字母a,b,c,d代表顯著性差異，統(tǒng)計(jì)分析為ANOVA分析，Bonferroni檢驗(yàn)(α=0.05)。Fig3-3IonomechangesofCol-0,nat1,nat2,nat1nat2inseeds.TheconcentrationsofFe,Cu,CoinseedsofCol-0andnat1andnat2singlemutantsanddoublemutantsgrowninartificialsoil.Metalcontents(Fe,Cu,Co)weredeterminedbyInductivelyICP-MS.Lowercasea,b,c,dindicatestatisticaldifferences.Dataevaluationwasdonewithaone-wayANOVAusingaBonferronitest(α=0.05).3.1.4nat1nat2突變體各組織器官銅、鐵、鈷含量明顯變化為了探究NAT1及NAT2如何調(diào)控?cái)M南芥內(nèi)銅、鐵、鈷的穩(wěn)態(tài)，將Col-0、nat1nat2雙突變體在Hoagland培養(yǎng)液中進(jìn)行7周的水培培養(yǎng)后，分別檢測(cè)植株生長(zhǎng)時(shí)期各個(gè)組織器官中銅、鐵、鈷的離子含量。檢測(cè)結(jié)果表明水培體系中的nat1nat2雙突變體根部銅和鈷的含量顯著升高，同時(shí)地上部組織器官老葉、幼葉、花、角果、種子、莖中的離子含量顯著下降（圖3-4A，B），這說(shuō)明銅、鈷在向地上部運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程中出現(xiàn)了阻礙；而鐵的含量雖然在地上部老葉中含量與野生型沒(méi)有差異，但是在幼葉、種子等組織器官內(nèi)含量顯著下降（圖3-4C），這說(shuō)明鐵在地上部的運(yùn)輸過(guò)程出現(xiàn)了異常。結(jié)合前面的葉片和種子的離子檢測(cè)結(jié)果，nat1nat2突變體離子組表型可能是由于NAT1、NAT2功能異常所導(dǎo)致的，推測(cè)NAT1以及NAT2共同參與銅、鈷由地下部轉(zhuǎn)運(yùn)至地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，鐵在地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。


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