為了解決食品安全問題及改善非法添加物在我國明令禁止而屢禁不止的現(xiàn)象。利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建庫容量大、適應(yīng)性強、穩(wěn)定性高的多樣化重組抗體資源庫,旨在篩選出特異性強、親和力高的食品安全危害物重組抗體以應(yīng)對突發(fā)食品安全事件,為建立快速高效的檢測方法奠定基礎(chǔ)。本研究選取β-興奮劑類藥物中的西馬特羅（Cimaterol,CIM）進行研究。采用聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)（PCR）和逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù),從未經(jīng)免疫的健康BALB/c小鼠脾臟中提取RNA,以經(jīng)RT-PCR獲得的鼠源c DNA第一鏈為模板,設(shè)計引物擴增鼠源抗體重鏈（VH）和輕鏈（VL）可變區(qū)基因,利用重疊延伸PCR（SOE-PCR）擴增鼠源單鏈抗體（Sc Fv）基因。通過DNA連接、電轉(zhuǎn)等技術(shù)構(gòu)建重組噬菌粒,經(jīng)輔助噬菌體M13K07救援后,構(gòu)建天然鼠源噬菌體Sc Fv文庫�；驕y序分析抗體基因的多樣性和完整性。應(yīng)用重氮化法制備人工免疫抗原CIM-BSA和檢測抗原CIM-OVA,并用UV、SDS-PAGE、質(zhì)譜三種方法進行完全抗原的鑒定。進而以人工完全抗原為靶抗原,對構(gòu)建的鼠源噬菌體Sc Fv文庫進行親和淘選,使攜帶抗西馬特羅表面抗原... 

【文章來源】：鄭州大學河南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

SOE-PCR拼接ScFv抗體基因ScFvForSfiIScFvScFvRevNotI

第二章鼠源天然抗體庫的構(gòu)建與鑒定22驟完成后，微量核酸分析儀檢測RNA濃度及純度，結(jié)果顯示鼠基因組DNA濃度為1239ng/μL，A260/A280為1.903。進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定時為了防止RNA降解，將電泳的膠槽等電泳設(shè)備及上樣的槍頭用DEPC水浸泡[50]。完整的RNA進行瓊脂糖電泳時，會出現(xiàn)28S和18SrRNA兩條條帶且前者亮度比后者強一倍左右，由電泳結(jié)果（圖2.2）可知提取的RNA完整性良好。圖2.2小鼠RNA電泳結(jié)果1-3：RNA樣品Figure2.2RNAagarosegelelectrophoresisassays1-3:RNAsamples2.3.2VH與VL的電泳結(jié)果重鏈可變區(qū)上游引物有5條，下游引物4條，可以組成的重鏈PCR擴增組合有20對。輕鏈可變區(qū)上游引物有5條，下游引物有3條，可以組成的PCR擴增組合有15對。同時考慮每條引物的兼并性，提高VH、VL可變區(qū)的多樣性，分別對VH、VL擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收。結(jié)果如圖2.3所示。VH片段大小為432bp（圖2.3A），VL片段大小為312bp（圖2.3B），與預(yù)期結(jié)果相符，研究結(jié)果表明，可以用于ScFv的合成。123

第二章鼠源天然抗體庫的構(gòu)建與鑒定23圖2.3VH與VL電泳結(jié)果Maker：DL2000DNAMarker；1-2（A）：VH基因產(chǎn)物；1-2（B）：VL基因產(chǎn)物Figure2.3VHandVLagarosegelelectrophoresisassaysMaker:DL2000DNAMarker;1-2(A):VHgeneproducts;1-2(B):VLgeneproducts2.3.3ScFv擴增的電泳結(jié)果VH、VL大量擴增用膠回收試劑盒回收純化，采用SOE-PCR法合成ScFv全長基因，片段大小約為780bp，電泳鑒定后，大量擴增并回收，回收產(chǎn)物即為小鼠單鏈抗體基因。結(jié)果如圖2.4所示。圖2.4ScFv擴增電泳結(jié)果Maker：DL2000DNAMarker；1-4:ScFv基因產(chǎn)物（A）Maker12（B）Maker12－312bp100bp100bp－750bp500bp2000bp2000bp5000bp1000bp250bp3000bp1000bp1500bp750bp500bp250bp－432bp－－－－－－－－－－－－－Figure2.4ElectrophoresisassaysofScFvamplifiedMaker:DL2000DNAMarker;1-4:ScFvgeneproducts

【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白原核表達載體的構(gòu)建、表達及蛋白純化[J]. 劉玉偉,辛長勛,孫盼盼,王碩,高梅,時建立,彭喆,吳曉燕,王永明,李俊.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 2019(24)
[2]天然鼠源噬菌體抗體庫的構(gòu)建及抗雞堆型艾美耳球蟲裂殖子單鏈抗體的篩選（英文）[J]. 康茜,任志軍,唐欣浩,王雪偉,陳穎彬,劉立元,秦建華,趙月蘭.  中國獸醫(yī)學報. 2018(11)
[3]高通量篩選大容量抗體庫的方法學研究進展[J]. 趙雪玉,吳蓉.  西北國防醫(yī)學雜志. 2018(01)
[4]肉品生產(chǎn)中禁用藥物西馬特羅研究進展[J]. 熊琳,萍閻,高雅琴,李維紅,楊曉玲.  食品安全質(zhì)量檢測學報. 2017(01)
[5]西馬特羅單克隆抗體的制備及免疫學特性鑒定[J]. 李君華,吳萌,程華,李亞璞,閆靜輝,李春生.  畜牧與獸醫(yī). 2016(03)
[6]西馬特羅免疫抗原合成方法的比較[J]. 李春生,李君華,武孝利,李素紅,閆靜輝,吳萌.  畜牧與獸醫(yī). 2014(08)
[7]動物性食品中β-興奮劑殘留概述[J]. 翟福麗,賴克強,張衍亮,黃軼群.  食品科學. 2011(05)
[8]我國動物疫病防控的問題與思考[J]. 張改平.  中國家禽. 2011(01)
[9]噬菌體抗體庫中篩選抗GST單鏈抗體及其活性鑒定[J]. 唐喆偉,韓紅輝,杜冰,王群,錢旻,李愷.  現(xiàn)代免疫學. 2010(05)
[10]抗EGFRvⅢ噬菌體抗體庫的構(gòu)建和篩選[J]. 周敏,石必枝,顧健人,李宗海.  中國生物工程雜志. 2010(04)

碩士論文
[1]廣譜有機磷農(nóng)藥單克隆抗體、單鏈抗體的制備及免疫檢測技術(shù)研究[D]. 張曉帥.蘭州大學 2018
[2]噬菌體天然抗體庫淘選及篩選方法的優(yōu)化[D]. 蔣紅欣.上海交通大學 2018
[3]豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建與篩選[D]. 張秋麗.鄭州大學 2017
[4]GPC3單鏈抗體的篩選、多克隆抗體制備以及在肝細胞癌檢測中的應(yīng)用[D]. 汪勝豪.浙江大學 2018
[5]抗豬流行性腹瀉病毒豬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc的構(gòu)建、表達及活性鑒定[D]. 宋曉峰.河南農(nóng)業(yè)大學 2016
[6]重疊延伸PCR（SOE PCR）技術(shù)在洛伐他汀九酮合成酶基因克隆中的應(yīng)用[D]. 黃卓.海南大學 2010



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