為了解決食品安全問題及改善非法添加物在我國(guó)明令禁止而屢禁不止的現(xiàn)象。利用噬菌體展示技術(shù)構(gòu)建庫(kù)容量大、適應(yīng)性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的多樣化重組抗體資源庫(kù),旨在篩選出特異性強(qiáng)、親和力高的食品安全危害物重組抗體以應(yīng)對(duì)突發(fā)食品安全事件,為建立快速高效的檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。本研究選取β-興奮劑類藥物中的西馬特羅（Cimaterol,CIM）進(jìn)行研究。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）和逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù),從未經(jīng)免疫的健康BALB/c小鼠脾臟中提取RNA,以經(jīng)RT-PCR獲得的鼠源c DNA第一鏈為模板,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增鼠源抗體重鏈（VH）和輕鏈（VL）可變區(qū)基因,利用重疊延伸PCR（SOE-PCR）擴(kuò)增鼠源單鏈抗體（Sc Fv）基因。通過(guò)DNA連接、電轉(zhuǎn)等技術(shù)構(gòu)建重組噬菌粒,經(jīng)輔助噬菌體M13K07救援后,構(gòu)建天然鼠源噬菌體Sc Fv文庫(kù)�；驕y(cè)序分析抗體基因的多樣性和完整性。應(yīng)用重氮化法制備人工免疫抗原CIM-BSA和檢測(cè)抗原CIM-OVA,并用UV、SDS-PAGE、質(zhì)譜三種方法進(jìn)行完全抗原的鑒定。進(jìn)而以人工完全抗原為靶抗原,對(duì)構(gòu)建的鼠源噬菌體Sc Fv文庫(kù)進(jìn)行親和淘選,使攜帶抗西馬特羅表面抗原... 

【文章來(lái)源】：鄭州大學(xué)河南省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：76 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

SOE-PCR拼接ScFv抗體基因ScFvForSfiIScFvScFvRevNotI

第二章鼠源天然抗體庫(kù)的構(gòu)建與鑒定22驟完成后，微量核酸分析儀檢測(cè)RNA濃度及純度，結(jié)果顯示鼠基因組DNA濃度為1239ng/μL，A260/A280為1.903。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定時(shí)為了防止RNA降解，將電泳的膠槽等電泳設(shè)備及上樣的槍頭用DEPC水浸泡[50]。完整的RNA進(jìn)行瓊脂糖電泳時(shí)，會(huì)出現(xiàn)28S和18SrRNA兩條條帶且前者亮度比后者強(qiáng)一倍左右，由電泳結(jié)果（圖2.2）可知提取的RNA完整性良好。圖2.2小鼠RNA電泳結(jié)果1-3：RNA樣品Figure2.2RNAagarosegelelectrophoresisassays1-3:RNAsamples2.3.2VH與VL的電泳結(jié)果重鏈可變區(qū)上游引物有5條，下游引物4條，可以組成的重鏈PCR擴(kuò)增組合有20對(duì)。輕鏈可變區(qū)上游引物有5條，下游引物有3條，可以組成的PCR擴(kuò)增組合有15對(duì)。同時(shí)考慮每條引物的兼并性，提高VH、VL可變區(qū)的多樣性，分別對(duì)VH、VL擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收。結(jié)果如圖2.3所示。VH片段大小為432bp（圖2.3A），VL片段大小為312bp（圖2.3B），與預(yù)期結(jié)果相符，研究結(jié)果表明，可以用于ScFv的合成。123

第二章鼠源天然抗體庫(kù)的構(gòu)建與鑒定23圖2.3VH與VL電泳結(jié)果Maker：DL2000DNAMarker；1-2（A）：VH基因產(chǎn)物；1-2（B）：VL基因產(chǎn)物Figure2.3VHandVLagarosegelelectrophoresisassaysMaker:DL2000DNAMarker;1-2(A):VHgeneproducts;1-2(B):VLgeneproducts2.3.3ScFv擴(kuò)增的電泳結(jié)果VH、VL大量擴(kuò)增用膠回收試劑盒回收純化，采用SOE-PCR法合成ScFv全長(zhǎng)基因，片段大小約為780bp，電泳鑒定后，大量擴(kuò)增并回收，回收產(chǎn)物即為小鼠單鏈抗體基因。結(jié)果如圖2.4所示。圖2.4ScFv擴(kuò)增電泳結(jié)果Maker：DL2000DNAMarker；1-4:ScFv基因產(chǎn)物（A）Maker12（B）Maker12－312bp100bp100bp－750bp500bp2000bp2000bp5000bp1000bp250bp3000bp1000bp1500bp750bp500bp250bp－432bp－－－－－－－－－－－－－Figure2.4ElectrophoresisassaysofScFvamplifiedMaker:DL2000DNAMarker;1-4:ScFvgeneproducts

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[3]豬圓環(huán)病毒Ⅱ型Cap蛋白噬菌體單鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與篩選[D]. 張秋麗.鄭州大學(xué) 2017
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