RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein, RBP）是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子,參與包括蛋白質(zhì)復(fù)合物的協(xié)調(diào)與穩(wěn)定、RNA的加工與成熟以及mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定、翻譯和降解等重要的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。而RBP和RNA之間的相互作用可以在它們各自的生物學(xué)過(guò)程中起到重要作用。因此,快速、準(zhǔn)確檢測(cè)RBP-RNA相互作用的技術(shù)對(duì)研究RBP和RNA的功能至關(guān)重要。對(duì)近些年發(fā)展起來(lái)的RNA純化的染色質(zhì)分離（chromatin isolation by RNA purification,ChIRP）、RNA靶標(biāo)的捕獲雜交分析（capture hybridization analysis of RNA targets,CHART）、三分子熒光互補(bǔ)技術(shù)（trimolecular fluorescence complementation,TriFC）、RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）、紫外交聯(lián)免疫沉淀（UV-crosslinking and immunoprecipitation,CLIP）、RNA Pull-down和RNA電泳遷移分析等主要RBP-RNA... 

【文章來(lái)源】：生物技術(shù)進(jìn)展. 2020,10(03)

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

TriFC技術(shù)原理示意圖

傳統(tǒng)的CLIP方法在逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,交聯(lián)位點(diǎn)氨基酸殘留會(huì)引起逆轉(zhuǎn)錄的突變、缺失甚至是終止,導(dǎo)致缺少5′接頭的截短cDNA,而3′接頭和5′接頭是后續(xù)PCR擴(kuò)增所必須的,致使截?cái)喽痰腸DNA在CLIP中沒(méi)有擴(kuò)增,為了解決這一問(wèn)題,K?nig等[39]在CLIP基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)了單核苷酸分離CLIP(iCLIP)技術(shù)。iCLIP技術(shù)可巧妙利用交聯(lián)位置能夠抑制逆轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行這一特點(diǎn),通過(guò)RT引物將3′接頭與cDNA相連,再在環(huán)化酶的作用下將cDNA環(huán)化,隨后再通過(guò)RT引物中的BamHⅠ酶切位點(diǎn)使環(huán)狀cDNA線性化,實(shí)現(xiàn)對(duì)正常和截短的cDNAs的擴(kuò)增和測(cè)序,從而可以在單核苷酸水平上精確的確定蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)位點(diǎn)(圖2)。iCLIP技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于RBPs在選擇性剪接、可變聚腺苷酸化、RNA甲基化、mRNA穩(wěn)定性等方面的功能研究[40-43]。通過(guò)該技術(shù)確定了不同RBPs的高分辨率RNA剪接圖譜,從而能夠評(píng)估RBP結(jié)合在替代外顯子周?chē)奈恢萌绾螞Q定它們的剪接功能,更重要的是,除了識(shí)別RBP結(jié)合位點(diǎn)外,iCLIP還可以對(duì)RBP-RNA相互作用的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行定量分析。例如,通過(guò)定量iCLIP數(shù)據(jù)證實(shí)RNA結(jié)合蛋白hnRNPC與剪接因子U2AF65在許多剪接位點(diǎn)上存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系,hnRNPC的缺失導(dǎo)致U2AF65獲得了數(shù)百個(gè)Alu元件的識(shí)別權(quán),致使先前被抑制的Alu外顯子錯(cuò)誤的形成,這嚴(yán)重破壞了轉(zhuǎn)錄本功能,而hnRNPC在正常生理?xiàng)l件下能夠阻止這種錯(cuò)誤識(shí)別,進(jìn)而在全基因組范圍內(nèi)維持轉(zhuǎn)錄組的穩(wěn)定發(fā)揮了關(guān)鍵作用[44]。1.5.4 優(yōu)化的CLIP(enhanced CLIP,eCLIP)

盡管iCLIP很大程度地提高了分辨率,消除了PCR擴(kuò)增的偏好性,提高了其擴(kuò)增效率,但由于iCLIP反應(yīng)步驟較多,環(huán)化效率不高,熟練操作較困難,且需消耗大量的原材料,這些都限制了iCLIP的廣泛應(yīng)用。Van Nostrand等[45]在iCLIP技術(shù)基礎(chǔ)上對(duì)該技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步改進(jìn),提出了一種全新的CLIP方法,稱(chēng)為優(yōu)化的CLIP(eCLIP)。該方法分兩步去添加接頭,首先將一個(gè)3′RNA接頭連接到交聯(lián)的RNA片段上,逆轉(zhuǎn)錄后再將一個(gè)3′ssDNA接頭連接到逆轉(zhuǎn)錄終止端cDNA處,舍去了環(huán)化這一步,降低了連接失敗導(dǎo)致的RNA片段損失,而且大大縮短了實(shí)驗(yàn)的手動(dòng)操作時(shí)間(圖3)。而eCLIIP技術(shù)結(jié)合高通量測(cè)序,極大的提高了建庫(kù)的成功率,改進(jìn)之后的方法相比普通的CLIP-seq而言,RBPs靶標(biāo)識(shí)別率提高了2～3倍,該方法為RBPs在全基因組范圍內(nèi)的maps提供了一個(gè)更加強(qiáng)大、標(biāo)準(zhǔn)化的框架。利用此方法,科學(xué)家們揭示了眾多蛋白調(diào)控RNA的新功能,如eIF4A3在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用[46], MOV10-mRNA 3′UTR和MOV10L1-piRNA在哺乳動(dòng)物睪丸發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制[47]。1.5.5 基于SpyTag的CLIP(SpyTag-based CLIP,SpyCLIP)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]RNA結(jié)合蛋白與RNA相互作用鑒定技術(shù)[J]. 陳偉,許馨,孫紹光.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 2017(02)
[2]利用CLIP技術(shù)研究蛋白質(zhì)和RNA的相互作用[J]. 周德建,葉克窮.  生命科學(xué). 2014(03)



本文編號(hào)：3432812