RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein, RBP）是基因表達調(diào)控的關(guān)鍵因子,參與包括蛋白質(zhì)復(fù)合物的協(xié)調(diào)與穩(wěn)定、RNA的加工與成熟以及mRNA的轉(zhuǎn)運、穩(wěn)定、翻譯和降解等重要的細胞生物學(xué)過程。而RBP和RNA之間的相互作用可以在它們各自的生物學(xué)過程中起到重要作用。因此,快速、準確檢測RBP-RNA相互作用的技術(shù)對研究RBP和RNA的功能至關(guān)重要。對近些年發(fā)展起來的RNA純化的染色質(zhì)分離（chromatin isolation by RNA purification,ChIRP）、RNA靶標的捕獲雜交分析（capture hybridization analysis of RNA targets,CHART）、三分子熒光互補技術(shù)（trimolecular fluorescence complementation,TriFC）、RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP）、紫外交聯(lián)免疫沉淀（UV-crosslinking and immunoprecipitation,CLIP）、RNA Pull-down和RNA電泳遷移分析等主要RBP-RNA... 

【文章來源】：生物技術(shù)進展. 2020,10(03)

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

TriFC技術(shù)原理示意圖

傳統(tǒng)的CLIP方法在逆轉(zhuǎn)錄過程中,交聯(lián)位點氨基酸殘留會引起逆轉(zhuǎn)錄的突變、缺失甚至是終止,導(dǎo)致缺少5′接頭的截短cDNA,而3′接頭和5′接頭是后續(xù)PCR擴增所必須的,致使截斷短的cDNA在CLIP中沒有擴增,為了解決這一問題,K?nig等[39]在CLIP基礎(chǔ)上開發(fā)了單核苷酸分離CLIP(iCLIP)技術(shù)。iCLIP技術(shù)可巧妙利用交聯(lián)位置能夠抑制逆轉(zhuǎn)錄的進行這一特點,通過RT引物將3′接頭與cDNA相連,再在環(huán)化酶的作用下將cDNA環(huán)化,隨后再通過RT引物中的BamHⅠ酶切位點使環(huán)狀cDNA線性化,實現(xiàn)對正常和截短的cDNAs的擴增和測序,從而可以在單核苷酸水平上精確的確定蛋白質(zhì)-RNA交聯(lián)位點(圖2)。iCLIP技術(shù)已經(jīng)成功地應(yīng)用于RBPs在選擇性剪接、可變聚腺苷酸化、RNA甲基化、mRNA穩(wěn)定性等方面的功能研究[40-43]。通過該技術(shù)確定了不同RBPs的高分辨率RNA剪接圖譜,從而能夠評估RBP結(jié)合在替代外顯子周圍的位置如何決定它們的剪接功能,更重要的是,除了識別RBP結(jié)合位點外,iCLIP還可以對RBP-RNA相互作用的動態(tài)變化進行定量分析。例如,通過定量iCLIP數(shù)據(jù)證實RNA結(jié)合蛋白hnRNPC與剪接因子U2AF65在許多剪接位點上存在競爭關(guān)系,hnRNPC的缺失導(dǎo)致U2AF65獲得了數(shù)百個Alu元件的識別權(quán),致使先前被抑制的Alu外顯子錯誤的形成,這嚴重破壞了轉(zhuǎn)錄本功能,而hnRNPC在正常生理條件下能夠阻止這種錯誤識別,進而在全基因組范圍內(nèi)維持轉(zhuǎn)錄組的穩(wěn)定發(fā)揮了關(guān)鍵作用[44]。1.5.4 優(yōu)化的CLIP(enhanced CLIP,eCLIP)

盡管iCLIP很大程度地提高了分辨率,消除了PCR擴增的偏好性,提高了其擴增效率,但由于iCLIP反應(yīng)步驟較多,環(huán)化效率不高,熟練操作較困難,且需消耗大量的原材料,這些都限制了iCLIP的廣泛應(yīng)用。Van Nostrand等[45]在iCLIP技術(shù)基礎(chǔ)上對該技術(shù)進行進一步改進,提出了一種全新的CLIP方法,稱為優(yōu)化的CLIP(eCLIP)。該方法分兩步去添加接頭,首先將一個3′RNA接頭連接到交聯(lián)的RNA片段上,逆轉(zhuǎn)錄后再將一個3′ssDNA接頭連接到逆轉(zhuǎn)錄終止端cDNA處,舍去了環(huán)化這一步,降低了連接失敗導(dǎo)致的RNA片段損失,而且大大縮短了實驗的手動操作時間(圖3)。而eCLIIP技術(shù)結(jié)合高通量測序,極大的提高了建庫的成功率,改進之后的方法相比普通的CLIP-seq而言,RBPs靶標識別率提高了2～3倍,該方法為RBPs在全基因組范圍內(nèi)的maps提供了一個更加強大、標準化的框架。利用此方法,科學(xué)家們揭示了眾多蛋白調(diào)控RNA的新功能,如eIF4A3在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中的作用[46], MOV10-mRNA 3′UTR和MOV10L1-piRNA在哺乳動物睪丸發(fā)育中的調(diào)控機制[47]。1.5.5 基于SpyTag的CLIP(SpyTag-based CLIP,SpyCLIP)

【參考文獻】：
期刊論文
[1]RNA結(jié)合蛋白與RNA相互作用鑒定技術(shù)[J]. 陳偉,許馨,孫紹光.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2017(02)
[2]利用CLIP技術(shù)研究蛋白質(zhì)和RNA的相互作用[J]. 周德建,葉克窮.  生命科學(xué). 2014(03)



本文編號：3432812