發(fā)布時間：2021-10-10 00:12

　　[目的]克隆非洲爪蛙prmt5. L基因并分析其在胚胎發(fā)育中的時空表達譜。[方法]收集胚胎,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄制備c DNA。設計特異引物,PCR擴增prmt5. L基因的ORF序列,連接到p CS2+載體構建p CS2+prmt5. L重組質(zhì)粒,連接位點為EcoRⅠ和XhoⅠ。經(jīng)雙酶切和測序驗證成功構建p CS2+prmt5. L重組質(zhì)粒。將p CS2+prmt5. L重組質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切,T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄獲得prmt5. L的反義探針。收集不同時期的爪蛙胚胎,固定并脫水后經(jīng)原位雜交檢測prmt5. L在胚胎發(fā)育中的表達情況。通過序列比對和進化樹分析PRMT5在進化中的保守性。[結(jié)果]成功克隆非洲爪蛙prmt5. L基因,原位雜交檢測了prmt5. L在早期胚胎中的時空表達譜。序列比對和進化樹發(fā)現(xiàn)prmt5. L蛋白在進化中非常保守。[結(jié)論]成功構建了p CS2+prmt5. L重組質(zhì)粒。prmt5. L基因在胚胎發(fā)育中呈現(xiàn)動態(tài)表達且prmt5. L蛋白在進化中非常保守。 

【文章來源】：生物技術. 2020,30(01)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

非洲爪蛙胚胎總RNA電泳圖

以制備好的cDNA為模板，PCR擴增非洲爪蛙prmt5.L基因的ORF序列，電泳檢測PCR擴增得到的目的片段。結(jié)果顯示，獲得特異的大小在2 kb左右的目的片段。該目的片段大小與從NCBI數(shù)據(jù)庫中查得的非洲爪蛙prmt5.L基因(GenBank序列號:NM＿001095149)的CDS序列大小一致。2.3 pCS2+prmt5.L重組載體的構建以及雙酶切鑒定

將PCR產(chǎn)物純化后用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切，與此同時雙酶切pCS2+載體，將酶切好的目的片段和pCS2+載體純化后連接，構建重組載體。將該重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切提取的質(zhì)粒，電泳檢測。結(jié)果顯示，雙酶切產(chǎn)物有兩條帶，大于2 kb的條帶為pCS2+載體，另一條2 kb的條帶為目的片段。將雙酶切驗證正確的重組載體送樣測序，然后將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，比對結(jié)果顯示PCR擴增得到的prmt5.L的ORF序列與數(shù)據(jù)庫中的一致，說明成功構建了pCS2+prmt5.L重組載體。2.4 prmt5.L反義探針的制備


本文編號：3427261