血紅素（heme）是一類結(jié)構(gòu)中含鐵離子的卟啉類化合物,在生物體內(nèi)參與細胞電子呼吸鏈傳遞、活性氧分解、底物的催化氧化等重要生理功能;也可作為輔因子與過氧化物酶結(jié)合發(fā)揮催化氧化作用,其含量高低會影響酶活性。本研究以Escherichia coli BL21（DE3）為出發(fā)菌株,以血紅素合成途徑（C5途徑）為研究對象,通過分子改造,調(diào)控血紅素合成途徑上游起始物谷氨酸的代謝流和中間產(chǎn)物5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinicacid,ALA）轉(zhuǎn)運蛋白的表達,探究重組菌在血紅素合成和基因轉(zhuǎn)錄水平上的變化;將經(jīng)過改造的E.coli作為宿主菌表達血紅素過氧化物酶并優(yōu)化培養(yǎng)條件,探究血紅素途徑的改造對酶活力的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:（1）調(diào)控谷氨酸代謝流及過表達谷氨酰-tRNA還原酶（hemA）促進血紅素合成。選取小電導(dǎo)類機械敏感性離子通道（MscS）和3-脫氧-2-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶（AroG）進行調(diào)控。MscS在滲透壓調(diào)節(jié)、細胞分裂和氨基酸轉(zhuǎn)運中具有生理功能;AroG競爭磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）,分流了TCA的代謝通量,進而影響?-KG生成谷氨酸;HemA催化的反應(yīng)是C... 

【文章來源】：江南大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：51 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

血紅素結(jié)構(gòu)示意圖

第一章緒論3圖1-2ALA的結(jié)構(gòu)式Fig.1-2MolecularstructureofALA在生物體內(nèi)，ALA過量積累會對細胞產(chǎn)生毒害作用：ALA氧化會產(chǎn)生過量的活性氧，給生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等）帶來損傷；ALA代謝產(chǎn)物卟啉類物質(zhì)對細胞也有一定的毒性[21]，所以ALA合成高度嚴格保守。ALA通常由2種途徑合成[22]，分別是C4途徑和C5途徑，如圖1-3所示。C4途徑一般存在于哺乳動物、酵母、鳥類和紫色非硫光合細菌中，C5途徑則存在于藻類、高等植物和多種細菌中[23]，包括大腸桿菌（Escherichiacoli）。圖1-3ALA合成途徑Fig.1-3ThesyntheticpathwayofALAC4途徑由hemA基因編碼的5-氨基乙酰丙酸合成酶（5-aminolevulinicacidsynthase，ALAS）以5"-磷酸吡哆醛（5"-pyridoxalphosphate，PLP）作為輔因子[23,24]，催化前體琥珀酰輔酶A（Succinyl-CoA）、甘氨酸（Glycine）縮合生成ALA。C5途徑由谷氨酸出發(fā)，經(jīng)過3步酶促反應(yīng)產(chǎn)生成ALA，反應(yīng)過程有tRNA、ATP、NADPH參與[25]。谷氨酸經(jīng)過谷氨酰-tRNA合成酶[26,27]（GluRS，gltX編碼）、谷氨酰-tRNA還原酶[28,29]（GluTR，hemA編碼）和谷氨酰-1-半醛-2,1-轉(zhuǎn)氨酶[30,31]（GSA-AM，hemL編碼）形成ALA，其中GluTR催化反應(yīng)為限速步驟[31]。C4途徑和C5途徑在ALA的后續(xù)代謝直至生成血紅素的過程相同。2)小電導(dǎo)類機械敏感性離子通道MscS和3-脫氧-阿拉伯庚酮糖-7磷酸合成酶AroG存在于多種生物體細胞壁內(nèi)的小電導(dǎo)類機械敏感型離子通道（Mechanosensitivechannelofsmallconductance，MscS）超家族，主要功能是滲透調(diào)節(jié)。在滲透壓改變時，通過對膜張力變化的感知來保護細胞免受低滲透壓的沖擊[32]。最初研究的細菌中MscS類通道現(xiàn)主要分為2類[33]：典型的大腸桿菌MscS（yggB）和K+依賴性MscK

第一章緒論3圖1-2ALA的結(jié)構(gòu)式Fig.1-2MolecularstructureofALA在生物體內(nèi)，ALA過量積累會對細胞產(chǎn)生毒害作用：ALA氧化會產(chǎn)生過量的活性氧，給生物大分子（蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等）帶來損傷；ALA代謝產(chǎn)物卟啉類物質(zhì)對細胞也有一定的毒性[21]，所以ALA合成高度嚴格保守。ALA通常由2種途徑合成[22]，分別是C4途徑和C5途徑，如圖1-3所示。C4途徑一般存在于哺乳動物、酵母、鳥類和紫色非硫光合細菌中，C5途徑則存在于藻類、高等植物和多種細菌中[23]，包括大腸桿菌（Escherichiacoli）。圖1-3ALA合成途徑Fig.1-3ThesyntheticpathwayofALAC4途徑由hemA基因編碼的5-氨基乙酰丙酸合成酶（5-aminolevulinicacidsynthase，ALAS）以5"-磷酸吡哆醛（5"-pyridoxalphosphate，PLP）作為輔因子[23,24]，催化前體琥珀酰輔酶A（Succinyl-CoA）、甘氨酸（Glycine）縮合生成ALA。C5途徑由谷氨酸出發(fā)，經(jīng)過3步酶促反應(yīng)產(chǎn)生成ALA，反應(yīng)過程有tRNA、ATP、NADPH參與[25]。谷氨酸經(jīng)過谷氨酰-tRNA合成酶[26,27]（GluRS，gltX編碼）、谷氨酰-tRNA還原酶[28,29]（GluTR，hemA編碼）和谷氨酰-1-半醛-2,1-轉(zhuǎn)氨酶[30,31]（GSA-AM，hemL編碼）形成ALA，其中GluTR催化反應(yīng)為限速步驟[31]。C4途徑和C5途徑在ALA的后續(xù)代謝直至生成血紅素的過程相同。2)小電導(dǎo)類機械敏感性離子通道MscS和3-脫氧-阿拉伯庚酮糖-7磷酸合成酶AroG存在于多種生物體細胞壁內(nèi)的小電導(dǎo)類機械敏感型離子通道（Mechanosensitivechannelofsmallconductance，MscS）超家族，主要功能是滲透調(diào)節(jié)。在滲透壓改變時，通過對膜張力變化的感知來保護細胞免受低滲透壓的沖擊[32]。最初研究的細菌中MscS類通道現(xiàn)主要分為2類[33]：典型的大腸桿菌MscS（yggB）和K+依賴性MscK

【參考文獻】：
期刊論文
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碩士論文
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[2]大腸桿菌血紅素合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達與調(diào)控[D]. 陳丹園.江南大學(xué) 2018
[3]谷氨酸棒桿菌中L-絲氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的研究[D]. 陳紫薇.江南大學(xué) 2018
[4]外向轉(zhuǎn)運蛋白對重組大腸桿菌5-氨基乙酰丙酸發(fā)酵的影響[D]. 沈觀宇.浙江大學(xué) 2018
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[6]大腸桿菌中5-氨基乙酰丙酸轉(zhuǎn)運蛋白的研究[D]. 張良程.天津科技大學(xué) 2016
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[8]芥藍抗壞血酸過氧化物酶在大腸桿菌中的基因表達及酶學(xué)性質(zhì)研究[D]. 黃加保.江南大學(xué) 2013



本文編號：3416032