奶牛子宮內(nèi)膜炎是目前世界各國(guó)奶牛養(yǎng)殖和生產(chǎn)中最為常見且造成損失最大的疾病之一,在我國(guó)65%至80%奶牛不孕是子宮內(nèi)膜炎所導(dǎo)致的。引起奶牛子宮內(nèi)膜炎的主要病原微生物包括細(xì)菌、支原體、鉤端螺旋體、病毒、真菌及毛滴蟲等,細(xì)菌中主要是大腸埃希菌、變形桿菌、鏈球菌和金黃色葡萄球菌等。為了確定大腸埃希菌致病能力與HPI毒力島irp1基因的關(guān)系,本試驗(yàn)使用自殺性質(zhì)粒p RE112構(gòu)建了大腸埃希菌irp1基因缺失株和回補(bǔ)株,進(jìn)行了irp1基因的功能驗(yàn)證,獲得如下結(jié)果:1. 對(duì)14株大腸埃希菌（編號(hào)E1-E14）進(jìn)行氯霉素抗性和irp1基因的檢測(cè),菌株E1、E4、E6、E8、E9和E12對(duì)氯霉素敏感且irp1基因陽(yáng)性,選取菌株E4進(jìn)行irp1基因敲除和回補(bǔ)。2. 使用重疊PCR法,以E4基因組為模板,融合irp1上下游同源臂,克隆融合片段到自殺性質(zhì)粒p RE112,成功構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒p REΔirp1。以含重組自殺性質(zhì)粒p REΔirp1的大腸埃希菌X7213為供體菌,大腸埃希菌E4為受體菌進(jìn)行共培養(yǎng),通過(guò)兩步同源重組篩選出缺失株E4Δirp1。最后同樣使用自殺性質(zhì)粒p RE112得到回補(bǔ)株E4Δi... 

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【部分圖文】：

FeDye3-y復(fù)合物結(jié)構(gòu)式（李葉芳,2012）

第二章大腸埃希菌缺失株E4Δirp1和回補(bǔ)株E4Δirp1-C的構(gòu)建和鑒定9圖2-1pRE112限制性圖譜（彭穎,2015）Figure2-1RestrictionmapofpRE112（pengying2015）本試驗(yàn)所用菌株和質(zhì)粒如下表（表2-1）。表2-1本試驗(yàn)所用菌株及質(zhì)粒列表Table2-1Strainsandplasmidsusedinthisexperiment菌株或質(zhì)粒Strainsorplasmids種類和基因型TypesandGenotypes來(lái)源Source菌株StrainsE4Amps，Cms實(shí)驗(yàn)室分離Δirp1E4，irp1基因缺失本人構(gòu)建Δirp1-CΔirp1，irp1基因缺失后回補(bǔ)本人構(gòu)建X7213自殺性質(zhì)粒pRE112宿主菌，DAP-實(shí)驗(yàn)室保存質(zhì)粒PlasmidspRE112pGP704自殺性質(zhì)粒，pir依賴，包含oriT，oriV，sacB，Cmr實(shí)驗(yàn)室保存pREΔirp1pRE112自殺性質(zhì)粒和irp1上下游序列，包含Cmr本人構(gòu)建pEASY-T1克隆載體，包含Ampr，Kanr實(shí)驗(yàn)室保存pREΔirp1-CpRE112自殺性質(zhì)粒，irp1及其上下游序列，包含Cmr本人構(gòu)建2.1.2主要試劑及儀器主要試劑及儀器，分別見表2-2和2-3。表2-2主要試劑Table2-2Mainreagents主要試劑Mainreagents生產(chǎn)廠家ManufacturerPrimerSTARMaxPremix（2X）寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司Taq酶、T4連接酶、內(nèi)切酶寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司氯霉素、氨芐西林粉末快速感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒（一步法）上海生工生物工程公司上海生工生物工程公司一站式DNA/RNA小量提取試劑盒上海生工生物工程公司UNIQ-10柱式微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒上海生工生物工程公司pEASY-T1CloningVector北京全式金公司

第二章大腸埃希菌缺失株E4Δirp1和回補(bǔ)株E4Δirp1-C的構(gòu)建和鑒定13物送去生物公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pREΔirp1。（4）缺失株Δirp1的篩選無(wú)痕缺失突變株篩選原理，如圖2-2，具體操作如下：A.含質(zhì)粒pREΔirp1的X7213與親本株E4共培養(yǎng)（單交換）取供體菌X7213100μL（含pREΔirp1）和受體菌大腸埃希菌E450μL，置于含500μL無(wú)菌LB液體的試管中（含DAP），37℃恒溫?fù)u床過(guò)夜搖菌，涂布于含有50μg/mL氯霉素的LB固體平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落PCR進(jìn)行鑒定。B.基因缺失株的篩選和鑒定（雙交換）PCR條帶大小和測(cè)序結(jié)果正確的即為陽(yáng)性接合子，于無(wú)鹽LB液體（含10%蔗糖）中連續(xù)傳代3-5代，取最后一代菌液稀釋涂板，37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定，PCR條帶大小和測(cè)序結(jié)果都正確的菌株即為突變株，命名為E4Δirp1。圖2-2缺失株E4Δirp1構(gòu)建原理示意圖Figure2-2TheschematicdiagramofconstructingE4Δirp1deletionstrain2.2.6回補(bǔ)株E4Δirp1-C的構(gòu)建為了確定后續(xù)試驗(yàn)得到的結(jié)果差異是由irp1基因的缺失所致，本試驗(yàn)使用自殺性質(zhì)粒介導(dǎo)同源重組的方法構(gòu)建了缺失株E4Δirp1的回補(bǔ)株E4Δirp1-C。使用irp1-A-F和irp1-B-R作為上下游引物、E4基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增，可以得到約1953bp的片段，其中包括irp1基因及其上下游同源臂，將自殺性質(zhì)粒與所得片段連接轉(zhuǎn)化后，最后用兩步同源重組的方法即可得到回補(bǔ)株E4Δirp1-C，具體操作步驟詳見2.2.5（周秀娟2015）。2.3結(jié)果2.3.1基因敲除菌株的篩選14株大腸埃希菌（E1-E14）經(jīng)過(guò)氯霉素檢測(cè)和irp1基因的PCR篩選，菌株E1、

【參考文獻(xiàn)】：
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