凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是一種兼具乳酸菌和芽孢桿菌優(yōu)勢(shì)的益生菌,相比于其他菌群,其芽孢體對(duì)熱、酸、堿、鹽等不敏感,目前已成為飼料領(lǐng)域微生態(tài)制劑的優(yōu)勢(shì)菌種之一。然而,它在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中常受到高溫、低pH以及膽鹽等多種環(huán)境脅迫,阻礙其發(fā)揮益生功能。因此,在前期從健康豬腸道內(nèi)容物中分離純化并鑒定出一株具有一定益生性的凝結(jié)芽孢桿菌WT-03的基礎(chǔ)上,本研究利用常壓室溫等離子體誘變（Atmospheric and room temperature plasma,ARTP）結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化（Adaptive laboratory evolution,ALE）策略對(duì)其誘變,選育出耐酸、耐膽鹽等抗逆性能明顯改善的目的菌株;進(jìn)而,從胞內(nèi)pH變化、細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞膜多層面初步探究其抗逆性機(jī)制;最后,考察并優(yōu)化其固態(tài)發(fā)酵豆粕的性能和發(fā)酵條件,對(duì)比發(fā)酵前后的豆粕營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),以期為提升豆粕發(fā)酵效率和產(chǎn)品品質(zhì)等提供研究基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容有:（1）采用ARTP結(jié)合適應(yīng)性進(jìn)化選育了耐酸、耐膽鹽的高抗逆性凝結(jié)芽孢桿菌。ARTP處理15 s后,凝結(jié)芽孢桿菌的致死率達(dá)到93.84%。利用含0.3%（w... 

【文章來(lái)源】：江蘇大學(xué)江蘇省

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

ARTP誘變及適應(yīng)性進(jìn)化流程示意

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文172.3.5適應(yīng)性進(jìn)化參考LeeJY等的方法對(duì)2.3.4.2中的菌株進(jìn)行為期40天的搖瓶馴化實(shí)驗(yàn)[102]。馴化初始pH為5.0，依次降低，最終pH為2.5。按照2%的比例，將培養(yǎng)16h的復(fù)篩菌株種子液轉(zhuǎn)接到初始MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3d；依次轉(zhuǎn)接至pH4.0、3.5、3.0和2.5的新鮮培養(yǎng)基中，如此不斷轉(zhuǎn)接，直至40d馴化結(jié)束。分別取第4d、9d、15d、24d以及40d的馴化細(xì)胞進(jìn)行存活率測(cè)定，且進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，具體步驟如圖2.1。圖2.1ARTP誘變及適應(yīng)性進(jìn)化流程示意圖.Fig2.1AflowdiagramofARTPmutagenesisandAdaptiveLabrotaryEvolution(ALE).圖中各字母分別表示：A:B.coagulansWT-03的活化培養(yǎng);B:誘變前的準(zhǔn)備;C:ARTP誘變;D:0.3%膽鹽平板初篩;E:24孔板耐酸性復(fù)篩;F:ARTP突變株的培養(yǎng);G:ARTP突變株的適應(yīng)性進(jìn)化(ALE);H:進(jìn)化突變株存活率的變化2.3.6抗逆性能評(píng)價(jià)參照Niederle等的方法[103]，采用體外胃腸道模擬消化系統(tǒng)對(duì)出發(fā)菌株和2.3.5中的突變株進(jìn)行益生性評(píng)價(jià)。取1mL對(duì)數(shù)期菌液，轉(zhuǎn)接到9mL模擬胃液中，混勻，37℃孵育3h；5000r/min、4℃離心10min，菌泥轉(zhuǎn)移到相同體積的模擬腸液中，37℃孵育3h。整個(gè)過(guò)程中，每隔1h取適量菌液利用稀釋平板涂布法計(jì)算存活率；且將存活率最高的菌株寄送至中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心進(jìn)行寄存。2.3.7數(shù)據(jù)處理

基于ARTP和適應(yīng)性進(jìn)化選育高抗逆性凝結(jié)芽孢桿菌及其發(fā)酵豆粕的研究18所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次平行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用EXCEL2010和Origin9.0進(jìn)行處理并繪圖，且結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平為p<0.05。2.4結(jié)果與討論2.4.1最佳誘變時(shí)間的確定為考察ARTP對(duì)B.coagulansWT-03細(xì)胞的殺傷程度，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)誘變菌體在MRS平板上的存活率繪制時(shí)間-致死率效應(yīng)關(guān)系圖，如圖2.2所示。圖2.2ARTP誘變時(shí)間對(duì)B.coagulansWT-03致死率的影響Fig2.2RelationofARTPirradiationtimeandlethalrateontheB.coagulansWT-03從圖2.2可以看出：與物理、化學(xué)等誘變方式不同的是，ARTP選育致死率--時(shí)間關(guān)系圖呈“鞍型”[104]。一定時(shí)間范圍內(nèi)，致死率與照射時(shí)間成正相關(guān)，存活率與時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。誘變時(shí)間為10s時(shí)，致死率為84.96%；照射時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致致死率的增加。15s時(shí)，致死率為93.84%；處理25s時(shí)，致死率達(dá)到99.42%，表明絕大部分細(xì)胞已死亡，這可能是因?yàn)锳RTP產(chǎn)生的活性粒子造成細(xì)胞組織的損傷、引起細(xì)胞死亡。根據(jù)zhang等的研究，ARTP致死率在90%~95%時(shí)，正突變發(fā)生概率最高[105]。因此本實(shí)驗(yàn)選擇15s作為最佳誘變時(shí)間。2.4.2ARTP突變菌株的篩選利用稀釋平板涂布法將最佳誘變時(shí)間下的菌懸液涂布在膽鹽篩選培養(yǎng)基上，根據(jù)生長(zhǎng)情況，初步挑出30株可耐受0.3%（w/v）膽鹽、生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好的突變


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