目的:通過(guò)研究miR-107在CVB3感染Hela細(xì)胞過(guò)程中的表達(dá)差異,探索其對(duì)CVB3復(fù)制的調(diào)控作用及機(jī)制,旨為CVB3感染相關(guān)疾病的臨床診斷提供新的理論依據(jù)和新型生物標(biāo)志物。方法:1.篩選出CVB3感染相關(guān)的miRNA;采用RT-qPCR方法確定miR-107的差異表達(dá)情況。2.在Hela細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或沉默miR-107后感染CVB3,通過(guò)RT-qPCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,并收集感染至6h的總蛋白;Western blot檢測(cè)病毒衣殼蛋白VP1的表達(dá),分析miR-107對(duì)CVB3復(fù)制增殖的影響;收集上清液進(jìn)行病毒蝕斑實(shí)驗(yàn),分析miR-107對(duì)CVB3釋放的影響。3.通過(guò)TargetScan和miRTarBase數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出miR-107的靶基因KLF4和BACE1,采用熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行靶點(diǎn)驗(yàn)證。4.Hela細(xì)胞過(guò)表達(dá)或沉默靶基因后感染CVB3并收集感染6h的總RNA和總蛋白,RT-qPCR和Western blot分析靶基因的表達(dá)變化,以及靶基因?qū)VB3復(fù)制增殖的影響;同時(shí)收集上清液進(jìn)行病毒蝕斑實(shí)驗(yàn),分析靶基因?qū)Σ《綜VB3釋放的影響。5.Hela細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-107的... 

【文章來(lái)源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：78 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

技術(shù)路線圖

江蘇大學(xué)碩士學(xué)位論文15上孵育1h后洗滌，1×TBS/TBuffer洗膜3次，每次洗滌20min。（8）顯色與分析：將在南京諾唯贊生物科技有限公司購(gòu)買(mǎi)的HRP-ECL曝光液的A、B液按照等比例混合，滴加于PVDF膜的蛋白面后使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍照分析、留存圖像，便于后續(xù)分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果。2.2.7結(jié)果統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)處理本實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用ImagineJ軟件進(jìn)行灰度掃描，采用GraphPadPrism7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以X±SD表示，組間差異比較采用雙側(cè)T檢驗(yàn)，P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.3.1CVB3在Hela細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制情況由Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，Hela細(xì)胞感染CVB34h后，VP1蛋白的表達(dá)可被實(shí)驗(yàn)檢出，在6h、8h表達(dá)水平顯著升高，依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果且避免臨界效應(yīng)，我們后續(xù)將選擇中間時(shí)間點(diǎn)6h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖2.1）（**P<0.01，***P<0.001）。圖2.1CVB3在hela細(xì)胞中的復(fù)制情況A.Hela細(xì)胞中CVB3感染不同時(shí)間點(diǎn)VP1的表達(dá)情況B.VP1灰度掃描Fig2.1CVB3replicationinhelacellsA.ExpressionofVP1atdifferenttimepointsinCVB3infectedHelaB.VP1grayscalescanresults2.3.2CVB3對(duì)miR-107表達(dá)的影響當(dāng)六孔板內(nèi)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時(shí)，實(shí)驗(yàn)組每孔加入10MOICVB3感染細(xì)胞，分別收取2h、4h、6h和未感染的Hela細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行熒光定量PCR（RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)，以U6作為內(nèi)參基因，檢測(cè)CVB3感染后miR-107表達(dá)量的變化。由RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，Hela細(xì)胞感染CVB3后，miR-107的表達(dá)呈現(xiàn)逐步上升的趨勢(shì)，在6h表達(dá)水平顯著升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.01）。

miR-107在柯薩奇B3病毒復(fù)制過(guò)程中的調(diào)控作用16圖2.2Hela細(xì)胞感染CVB3后不同時(shí)間點(diǎn)miR-107的表達(dá)情況Fig2.2ExpressionofmiR-107atdifferenttimepointsinCVB3infectedHela2.3.3miR-107對(duì)CVB3復(fù)制增殖的影響為了探討miR-107對(duì)CVB3復(fù)制增殖的影響，我們采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，在Hela細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)或敲減miR-107。通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)確定轉(zhuǎn)染效果后（圖2.3），由Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：miR-107過(guò)表達(dá)時(shí)，CVB3衣殼蛋白VP1的表達(dá)升高（圖2.4）。與之相反的是，敲減miR-107抑制了VP1的表達(dá)（圖2.5）（*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001）。圖2.3RT-qPCR檢測(cè)miR-107過(guò)表達(dá)和敲減效率A.RT-qPCR檢測(cè)mimics-107的轉(zhuǎn)染效率B.RT-qPCR檢測(cè)107-inhibitor的轉(zhuǎn)染效率Fig2.3RT-qPCRtodetecttheefficiencyofmimics-107and107-inhibitorA.RT-qPCRtodetectthetransfectionefficiencyofmimics-107B.RT-qPCRtodetectthetransfectionefficiencyof107-inhibitor

【參考文獻(xiàn)】：
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