SUMO化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,對(duì)植物正常生長(zhǎng)發(fā)育不可或缺。到目前為止已篩選到上千個(gè)可能的SUMO底物,但由于SUMO化修飾水平普遍很低,其生物學(xué)功能研究相對(duì)較少。該文詳細(xì)描述了檢測(cè)蛋白SUMO化修飾的常用方法,包括體外和體內(nèi)SUMO化實(shí)驗(yàn),以及SUMO化修飾位點(diǎn)的檢測(cè)方法,旨在為深入研究植物蛋白SUMO化修飾提供技術(shù)支持。 

【文章來(lái)源】：植物學(xué)報(bào). 2020,55(01)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

Protein X體外SUMO化修飾

(5)Western blot檢測(cè)用30μL 2×SDS上樣緩沖液重懸beads,100°C煮沸5分鐘,瞬時(shí)離心,混勻。1 000×g離心3分鐘,上樣。Western blot,anti-FLAG抗體僅在實(shí)驗(yàn)組(FLAG-SUMO1GG)檢測(cè)到目的條帶上方間隔×15 kDa(FLAG-SUMO1大約15 kDa)處有1條或多條條帶,說(shuō)明目的蛋白在煙草中能夠被SUMO化修飾。如圖2所示,只有與FLAG-SUMO1GG共表達(dá)時(shí),anti-FLAG抗體才能夠檢測(cè)到SUMO化修飾的GFP-protein X,說(shuō)明GFP-protein X是SUMO底物。5.2.2 擬南芥原生質(zhì)體中檢測(cè)SUMO化修飾方法

SUMO底物通常含有保守的ΨKXD/E序列,其中Ψ代表疏水性氨基酸,K是SUMO分子共價(jià)結(jié)合的賴氨酸,X為任意氨基酸,D/E為酸性氨基酸(天冬氨酸(D)或谷氨酸(E))。SUMO結(jié)合酶E2可識(shí)別ΨKXD/E基序,介導(dǎo)底物SUMO化修飾(Bernier-Villamor et al.,2002)。常用的SUMO化修飾分析軟件有GPS-SUMO(Zhaoet al.,2014)、SUMOplot(http://www.abgent.com/umoplot)以及JASSA(http://www.jassa.fr/index.hp?jassa)。但由于SUMO化修飾位點(diǎn)并非均是保守的ΨKXD/E基序,故還需要結(jié)合質(zhì)譜檢測(cè)進(jìn)行分析。為提高質(zhì)譜檢測(cè)效率,通常使用SUMO1H89R檢測(cè)底物的SUMO化修飾位點(diǎn)(Miller et al.,2010)。通過(guò)軟件分析和質(zhì)譜檢測(cè)獲得可能的SUMO化修飾結(jié)合位點(diǎn),然后通過(guò)SUMO化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。目前,判斷SUMO化修飾結(jié)合位點(diǎn)的主要依據(jù)是SUMO結(jié)合位點(diǎn)賴氨酸(K)突變成精氨酸(R)能抑制底物SUMO化修飾(Bernier-Villamor et al.,2002)。如圖4所示,Myc-protein X和FLAG-SUMO1GG在煙草中共表達(dá),IP(anti-Myc)產(chǎn)物用anti-FALG抗體能檢測(cè)到SUMO化修飾的Myc-protein X,說(shuō)明protein X是SUMO底物。當(dāng)把protein X兩個(gè)可能的SUMO化修飾結(jié)合位點(diǎn)K1和K2單獨(dú)突變后,仍能檢測(cè)到SUMO化修飾條帶,但2個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變(2KR)后,幾乎檢測(cè)不到,說(shuō)明K1和K2是protein X主要的SUMO化修飾結(jié)合位點(diǎn)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Arabidopsis SUMO protease ASP1 positively regulates flowering time partially through regulating FLC stability[J]. Xiangxiong Kong,Xi Luo,Gao-Ping Qu,Peng Liu,Jing Bo Jin.  Journal of Integrative Plant Biology. 2017(01)
[2]植物SUMO化修飾及其生物學(xué)功能[J]. 徐龐連,曾棉煒,黃麗霞,陽(yáng)成偉.  植物學(xué)通報(bào). 2008(05)



本文編號(hào)：3352122