深海是全球最大的生態(tài)系統(tǒng),根據(jù)深度可分為深層區(qū)（1000-3000m）,深淵區(qū)（3000-6000m）和超深淵區(qū)（6000-10000m）。深海是一個高壓、低溫（除了海底熱液口）、黑暗及寡營養(yǎng)的多重極端環(huán)境,深海環(huán)境被認(rèn)為是研究地球原始環(huán)境的一個窗口。壓力作為深海最顯著的環(huán)境因子,是如何影響深海微生物及其群落結(jié)構(gòu)的,仍然是一個值得研究的重要問題。因此研究深海嗜耐壓微生物群落結(jié)構(gòu)及其與環(huán)境因子的相互關(guān)系,分析嗜耐壓菌對壓力等極端環(huán)境的適應(yīng)機制,這對于生命的起源和演化這一重大科學(xué)問題具有重要意義。本文利用目前國際上最先進(jìn)的載人潛水器“蛟龍?zhí)枴辈杉奶窖笱牌趾铣顪Y與深淵沉積物樣品,采用不同的深海原位模擬培養(yǎng)條件,研究嗜耐壓微生物的群落結(jié)構(gòu)特征及其與環(huán)境因子的關(guān)系;并利用發(fā)現(xiàn)的深海耐壓新種,探索它的深海極端環(huán)境適應(yīng)機制。本文通過不同壓力、營養(yǎng)和傳代培養(yǎng)雅浦海溝五個不同站位的沉積物樣品,分析研究不同富集條件下嗜耐壓微生物的群落結(jié)構(gòu),并與未培養(yǎng)的原位微生物群落結(jié)構(gòu)對比分析,發(fā)現(xiàn)高壓低營養(yǎng)條件的富集產(chǎn)物多樣性豐富,且與原位微生物群落結(jié)構(gòu)最接近。同時壓力是影響富集培養(yǎng)原位微生物的最大因素,其次是... 

【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校 985工程院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

雅浦海溝地形特征

第1章緒論-15-圖1-2高壓對細(xì)胞及生物大分子的影響示意圖[99]Figure1-2ExamplesoftheeffectsofhighhydrostaticpressureoncellsandcellularcomponentsA：膜中的脂質(zhì)（流動-變硬）B：多聚蛋白組合（多聚體—單體）。C：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（螺旋—不可折疊）D：細(xì)胞運動性變差;E：核糖體的蛋白質(zhì)翻譯失敗。1.7.1核酸HHP能使DNA雙鏈分子的氫鍵變得更加穩(wěn)定，導(dǎo)致解鏈溫度Tm值升高，從而使得DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程變得更加困難[103]。例如，單鏈結(jié)合蛋白在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中起著穩(wěn)定DNA分子的作用。研究發(fā)現(xiàn)，對比分析耐受壓力的和不耐受壓力的希瓦氏菌（Shewanella），發(fā)現(xiàn)二者的DNA單鏈結(jié)合蛋白有差異。甘氨酸和脯氨酸的含量與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)，它們在壓力耐受菌株的DNA單鏈結(jié)合蛋白中含量較少。同時還發(fā)現(xiàn)，耐受壓力的菌株的DNA單鏈結(jié)合蛋白與DNA分子單鏈的結(jié)合濃度更低[104]。1.7.2脂類脂膜是目前存在的最具壓力敏感性的生物結(jié)構(gòu)之一。完整的生物膜是一種非常復(fù)雜的層狀磷脂雙層基質(zhì)，含有多種脂質(zhì)分子和大量具有多種生化功能的蛋白質(zhì)。在壓縮后，脂質(zhì)通過改變它們的構(gòu)象來適應(yīng)體積限制。因此，隨著壓力的增加，脂質(zhì)雙層失去流動性，變得對水和其他分子迅速不滲透，而對膜的最佳功能至關(guān)重要的蛋白質(zhì)-磷脂相互作用被削弱[105]。

第2章實驗材料與方法-25-質(zhì)檢，然后將產(chǎn)物與克隆載體連接，通過藍(lán)白斑篩選后，選擇陽性克隆子，提取質(zhì)粒，驗證質(zhì)粒，檢測質(zhì)粒的濃度。本研究所用質(zhì)粒載體是pMD18-T。通過公式換算成拷貝數(shù)（copies/μL），質(zhì)粒起始拷貝數(shù)換算公式（copies/μL）=濃度（ng/uL）*10-9*6.02*1023/（分子量*660），分子量=載體的大小+目的基因片段的大校（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：通過10倍梯度稀釋構(gòu)建好的質(zhì)粒，分別選擇16S標(biāo)準(zhǔn)品的10-1~10-7稀釋液用于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3）熒光定量PCR檢測：PCR循環(huán)條件為預(yù)變性95℃，3min；變性95℃，5sec，退火58℃，30sec，延伸72℃，1min，循環(huán)40次。2.2.4細(xì)菌群落多樣性分析微生物多樣性分析主要包括物種注釋、α多樣性分析、β多樣性分析和網(wǎng)絡(luò)分析，可根據(jù)物種組成和網(wǎng)絡(luò)分析，得出關(guān)鍵物種，從而分析關(guān)鍵物種在群落結(jié)構(gòu)中的作用。如果有其他影響因子參數(shù)，還可以RDA冗余分析，獲知影響因子對微生物群落結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系，詳見圖2-1。圖2-1細(xì)菌群落多樣性分析流程圖Figure2-1Flowchatofbacteriadiversity1.質(zhì)控和拼接：測序得到數(shù)據(jù)稱為原始數(shù)據(jù)（Rawdata），需要經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)控，得到有效的tags。（1）Reads過濾：Reads是高通量測序產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)。測序后需要去除N堿

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Distinct influence of trimethylamine N-oxide and high hydrostatic pressure on community structure and culturable deep-sea bacteria[J]. ZHANG Chan,ZHANG Wei-jia,YIN Qunjian,LI Xuegong,QI Xiaoqing,WU Long-fei.  Journal of Oceanology and Limnology. 2020(02)
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