數(shù)字PCR（Digital PCR, dPCR）是繼實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）之后發(fā)展的高靈敏核酸絕對(duì)定量分析技術(shù),通過把反應(yīng)體系均分到大量獨(dú)立的微反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并根據(jù)泊松分布和陽性比例來計(jì)算核酸拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)定量分析。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比,數(shù)字PCR技術(shù)不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線,具有更高靈敏度、準(zhǔn)確度及高耐受性,可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的絕對(duì)定量分析。近年來,隨著微流控技術(shù)日臻成熟,基于微流控技術(shù)的數(shù)字PCR技術(shù)得到了快速的發(fā)展,在基因突變檢測(cè)、拷貝數(shù)變異檢測(cè)、病毒微生物檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)以及測(cè)序等方面均得到廣泛的應(yīng)用。本文對(duì)數(shù)字PCR的原理、技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用進(jìn)行了概述。 

【文章來源】：化學(xué)進(jìn)展. 2020,32(05)北大核心SCICSCD

【文章頁數(shù)】：13 頁

【部分圖文】：

(a)基于毛細(xì)管的集成液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)[43];(b)基于噴墨打印技術(shù)的在線檢測(cè)的數(shù)字PCR系統(tǒng)[44]

Li等[46]發(fā)展了一種基于微孔陣列的乳化方法,可在PDMS微孔陣列中快速地產(chǎn)生單分散瓊脂糖液滴,并將其應(yīng)用于數(shù)字PCR的絕對(duì)定量分析(圖13b)。基于瓊脂糖液滴的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換特性使得能夠通過在-20 ℃下冷卻液滴陣列來形成穩(wěn)定的微珠,可保持每個(gè)液滴的單克隆性并對(duì)所需液滴進(jìn)行選擇性回收。利用DNA測(cè)序和流式細(xì)胞分選方法證明了液滴的單克隆性,顯示了該方法對(duì)單分子擴(kuò)增分析所具有的穩(wěn)定性和靈活性。Shen等[47, 48]提出了一種基于滑動(dòng)芯片的數(shù)字PCR系統(tǒng),可對(duì)核酸進(jìn)行絕對(duì)定量分析�；瑒�(dòng)芯片主要由兩塊緊密接觸的分別加工有微結(jié)構(gòu)的上下兩片玻璃平板組成,通過上下平板之間的滑動(dòng)完成PCR反應(yīng)液的引入與間隔,可形成1280個(gè)獨(dú)立的2.6 nL的液滴,如圖14a所示。該系統(tǒng)被應(yīng)用于定量檢測(cè)金黃葡萄球菌基因組DNA樣品。此外,基于滑動(dòng)芯片還發(fā)展了多體積數(shù)字PCR系統(tǒng)[49],顯著地提高了動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍(圖14b)。將該多體積數(shù)字PCR方法用于對(duì)人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)的病毒載量進(jìn)行定量分析,可實(shí)現(xiàn)1.8×103～1.2×107 copies/mL的濃度檢測(cè)范圍,其結(jié)果與常規(guī)方法檢測(cè)得到的結(jié)果一致[50]。

數(shù)字PCR(Digital PCR, dPCR)是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來的一種核酸分子絕對(duì)定量技術(shù)[5, 6]。該技術(shù)可理解為在大規(guī)模平行微反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行單分子水平的熒光PCR擴(kuò)增與計(jì)數(shù)式檢測(cè),相較于qPCR技術(shù),能夠直接計(jì)數(shù)DNA分子的個(gè)數(shù),可實(shí)現(xiàn)樣品的絕對(duì)定量分析。數(shù)字PCR過程主要包括樣品的分散、PCR擴(kuò)增以及熒光信號(hào)的采集與數(shù)據(jù)分析。該技術(shù)在有限稀釋模式下,使樣品模板隨機(jī)分散到數(shù)百個(gè)至數(shù)百萬個(gè)的獨(dú)立反應(yīng)單元中,每個(gè)反應(yīng)單元中可能包含有零個(gè)、一個(gè)或多個(gè)DNA模板分子,模板分子的分散符合泊松分布。PCR擴(kuò)增結(jié)束后有熒光信號(hào)單元記為1,無熒光信號(hào)則記為0,即根據(jù)熒光信號(hào)的有和無將反應(yīng)單元分別定義為陽性和陰性。通過對(duì)反應(yīng)單元總數(shù)和陽性反應(yīng)單元數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì),根據(jù)泊松分布公式即可計(jì)算出DNA模板分子的起始濃度,原理如圖1所示[7, 8]。理想情況下,當(dāng)待測(cè)樣品的DNA濃度被稀釋到很低水平時(shí),樣品溶液被分散到大量的反應(yīng)單元中,使每個(gè)反應(yīng)單元所含有的DNA分子數(shù)最多只有一個(gè),這種條件下,可通過對(duì)陽性反應(yīng)單元的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì),直接確定DNA模板分子的起始數(shù)目。但當(dāng)測(cè)定高濃度模板時(shí),部分反應(yīng)單元中含有兩個(gè)或兩個(gè)以上DNA分子,大量DNA模板分子的隨機(jī)分布情況符合泊松分布。因此,DNA模板分子的絕對(duì)濃度可以采用泊松分布概率公式計(jì)算[9]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)展[J]. 林彩琴,姚波.  化學(xué)進(jìn)展. 2012(12)



本文編號(hào)：3287946