數(shù)字PCR（Digital PCR, dPCR）是繼實時熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）之后發(fā)展的高靈敏核酸絕對定量分析技術(shù),通過把反應(yīng)體系均分到大量獨立的微反應(yīng)單元中進行PCR擴增,并根據(jù)泊松分布和陽性比例來計算核酸拷貝數(shù)實現(xiàn)定量分析。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比,數(shù)字PCR技術(shù)不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線,具有更高靈敏度、準(zhǔn)確度及高耐受性,可實現(xiàn)對樣品的絕對定量分析。近年來,隨著微流控技術(shù)日臻成熟,基于微流控技術(shù)的數(shù)字PCR技術(shù)得到了快速的發(fā)展,在基因突變檢測、拷貝數(shù)變異檢測、病毒微生物檢測、轉(zhuǎn)基因食品檢測以及測序等方面均得到廣泛的應(yīng)用。本文對數(shù)字PCR的原理、技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用進行了概述。 

【文章來源】：化學(xué)進展. 2020,32(05)北大核心SCICSCD

【文章頁數(shù)】：13 頁

【部分圖文】：

(a)基于毛細管的集成液滴數(shù)字PCR系統(tǒng)[43];(b)基于噴墨打印技術(shù)的在線檢測的數(shù)字PCR系統(tǒng)[44]

Li等[46]發(fā)展了一種基于微孔陣列的乳化方法,可在PDMS微孔陣列中快速地產(chǎn)生單分散瓊脂糖液滴,并將其應(yīng)用于數(shù)字PCR的絕對定量分析(圖13b)�；诃傊且旱蔚娜苣z-凝膠轉(zhuǎn)換特性使得能夠通過在-20 ℃下冷卻液滴陣列來形成穩(wěn)定的微珠,可保持每個液滴的單克隆性并對所需液滴進行選擇性回收。利用DNA測序和流式細胞分選方法證明了液滴的單克隆性,顯示了該方法對單分子擴增分析所具有的穩(wěn)定性和靈活性。Shen等[47, 48]提出了一種基于滑動芯片的數(shù)字PCR系統(tǒng),可對核酸進行絕對定量分析。滑動芯片主要由兩塊緊密接觸的分別加工有微結(jié)構(gòu)的上下兩片玻璃平板組成,通過上下平板之間的滑動完成PCR反應(yīng)液的引入與間隔,可形成1280個獨立的2.6 nL的液滴,如圖14a所示。該系統(tǒng)被應(yīng)用于定量檢測金黃葡萄球菌基因組DNA樣品。此外,基于滑動芯片還發(fā)展了多體積數(shù)字PCR系統(tǒng)[49],顯著地提高了動態(tài)檢測范圍(圖14b)。將該多體積數(shù)字PCR方法用于對人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)和丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)的病毒載量進行定量分析,可實現(xiàn)1.8×103～1.2×107 copies/mL的濃度檢測范圍,其結(jié)果與常規(guī)方法檢測得到的結(jié)果一致[50]。

數(shù)字PCR(Digital PCR, dPCR)是20世紀(jì)90年代末發(fā)展起來的一種核酸分子絕對定量技術(shù)[5, 6]。該技術(shù)可理解為在大規(guī)模平行微反應(yīng)器內(nèi)進行單分子水平的熒光PCR擴增與計數(shù)式檢測,相較于qPCR技術(shù),能夠直接計數(shù)DNA分子的個數(shù),可實現(xiàn)樣品的絕對定量分析。數(shù)字PCR過程主要包括樣品的分散、PCR擴增以及熒光信號的采集與數(shù)據(jù)分析。該技術(shù)在有限稀釋模式下,使樣品模板隨機分散到數(shù)百個至數(shù)百萬個的獨立反應(yīng)單元中,每個反應(yīng)單元中可能包含有零個、一個或多個DNA模板分子,模板分子的分散符合泊松分布。PCR擴增結(jié)束后有熒光信號單元記為1,無熒光信號則記為0,即根據(jù)熒光信號的有和無將反應(yīng)單元分別定義為陽性和陰性。通過對反應(yīng)單元總數(shù)和陽性反應(yīng)單元數(shù)目進行統(tǒng)計,根據(jù)泊松分布公式即可計算出DNA模板分子的起始濃度,原理如圖1所示[7, 8]。理想情況下,當(dāng)待測樣品的DNA濃度被稀釋到很低水平時,樣品溶液被分散到大量的反應(yīng)單元中,使每個反應(yīng)單元所含有的DNA分子數(shù)最多只有一個,這種條件下,可通過對陽性反應(yīng)單元的數(shù)目進行統(tǒng)計,直接確定DNA模板分子的起始數(shù)目。但當(dāng)測定高濃度模板時,部分反應(yīng)單元中含有兩個或兩個以上DNA分子,大量DNA模板分子的隨機分布情況符合泊松分布。因此,DNA模板分子的絕對濃度可以采用泊松分布概率公式計算[9]。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]數(shù)字PCR技術(shù)進展[J]. 林彩琴,姚波.  化學(xué)進展. 2012(12)



本文編號：3287946