運用鳥槍克隆術(shù),從環(huán)狀芽胞桿菌B2301基因組中克隆出乳糖酶編碼基因,其完整讀框大小為5 133bp,編碼1 710個氨基酸殘基,不含典型細(xì)菌信號肽序列,與已有報道的β-半乳糖苷酶的最高一致性為93.6%。初步表達(dá)和純化了此乳糖酶,重組乳糖酶在50℃（ONPG）/60℃（乳糖）和pH 6.0～6.5下表現(xiàn)出最高催化活性,Zn²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺、EDTA和SDS對重組酶表現(xiàn)出不同程度的抑制作用;該酶在50和55℃下催化合成低聚半乳糖的V_max分別為2.21和2.47 g/（L·h）,K_m分別為10.46和14.37 g/L。所獲得的乳糖酶具有以乳糖為底物酶法合成低聚半乳糖的優(yōu)良應(yīng)用屬性,可為后續(xù)針對此酶的高效表達(dá)與工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 

【文章來源】：食品與發(fā)酵工業(yè). 2020,46(15)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

Bgl Bc與其他β-半乳糖苷酶的相關(guān)關(guān)系

前人對B.circulans ATCC 31382β-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)功能相關(guān)關(guān)系解析研究中發(fā)現(xiàn)，其近N端811個氨基酸殘基組成的LacZ功能域，具有完整的β-半乳糖苷酶活性[20-22]。鑒于本研究克隆獲得的BglBc具有與菌株ATCC 31382β-半乳糖苷酶相似結(jié)構(gòu)，本研究對其近N端782個氨基酸殘基組成的功能域(BglD)在枯草桿菌WB600中成功分泌表達(dá)，表達(dá)酶活力達(dá)2.9 U/m L。進(jìn)一步對發(fā)酵上清酶液進(jìn)行分離純化，獲得在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)上呈現(xiàn)單一條帶的純酶樣品(圖2)。進(jìn)一步確定了重組BglD的GOS合成能力，該酶催化乳糖轉(zhuǎn)化為GOS的最高轉(zhuǎn)化率達(dá)52.5%(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))，與從B.circulans B2301制備的野生型乳糖酶催化合成GOS的性能相同[10]。可見，從B.circulans B2301成功克隆出的乳糖酶編碼基因bglBc的截短序列bglD仍然保留了原酶分子催化合成GOS的活性。后續(xù)對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

進(jìn)一步對純化的BglD酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果匯總于圖3和表1。以合成底物ONPG為底物時，乳糖酶BglD的最適作用溫度為50℃、最適作用p H為6.0～6.5;以天然底物乳糖為底物時，其最適作用溫度為60℃、最適作用pH為6.0～6.5(圖3-a、3-c)。此酶在50℃以下和pH 5.5～7.0之間具有較好的穩(wěn)定性(圖3-b、3-d)。同時發(fā)現(xiàn)，作用于天然底物乳糖，BglD的最適作用溫度更高，但最適作用pH沒有顯著差異，不同底物對其熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性也沒有顯著影響(圖3);BglD的最適作用溫度略低于B.circulans ATCC31382的乳糖酶BglD-D[22]。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號：3281290