內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）腔內(nèi)的甘露糖基化修飾共同存在于N-糖基化、糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定化、O-和C-甘露糖基化中,對于真核生物來說具有重要的作用。ER腔內(nèi)的甘露糖基化的底物供體為多萜醇磷酸甘露糖（Dol-P-Man）,因此Dol-P-Man的合成對于理解不同種類的糖基化修飾具有重要的意義。本研究原核表達(dá)純化了酵母Dol-P-Man的合成酶（Dpm1）,并鑒定了重要的DXD motif。利用純化的Dpm1蛋白,及簡單的植烷醇（Phytanol）代替復(fù)雜的多萜醇（Dolichol）,體外酶法合成了Dol-P-Man的替代結(jié)構(gòu)Phy-P-Man。在N-糖基化途徑中Alg3催化Dol-PPGlcNAc2-Man5和Dol-P-Man生成Dol-PP-GlcNAc2-Man6。通過體外酶反應(yīng),本研究證明PhyP-Man同樣能夠作為Alg3的底物供體用于N-糖基化途徑的研究,為以后合成高甘露糖型的N糖結(jié)構(gòu)及GPI、O-和C-甘露糖基化的研究奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2020,39(03)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：7 頁

【部分圖文】：

酵母重組蛋白M-Alg3的原核表達(dá)Western blotting圖

接下來，利用含有重組蛋白M-Alg3的大腸桿菌膜成份催化Phy-PP-M5與Phy-P-Man，反應(yīng)結(jié)束后酸解去掉脂肪鏈部分，純化糖鏈后LC-MS分析結(jié)果。如圖6(a）所示，與空載大腸桿菌膜成份比較，含有重組蛋白M-Alg3的大腸桿菌膜成份催化后多了一組峰。ESI-MS確證了2組峰分別起源于底物Phy-PP-M5(14.6,14.8）和產(chǎn)物Phy-PP-M6(15.4,15.5）（圖6(b））。綜上證明Phy-P-Man能夠被Alg3所催化應(yīng)用到N-糖基化途徑研究。3 結(jié)語

基于多萜醇磷酸甘露糖（Dol-P-Man）在ER糖基化4種修飾中的重要作用，本研究將利用酵母Dpm1進(jìn)行酶法合成，并采用結(jié)構(gòu)簡單的Phytano（含有20個碳），替代Dolichol（含有100個碳以上）（圖1）。首先構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Dpm1，轉(zhuǎn)入Rosetta DE3）大腸桿菌中，低溫過夜誘導(dǎo)。誘導(dǎo)菌體破碎提取細(xì)胞膜成份，溶解于去污劑Triton X-100，利用鎳親和層析純化。對500 mmol/L咪唑洗脫液SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2(a）顯示3×104左右，有一條明顯的條帶，與Dpm1預(yù)期的大小相一致，成功實(shí)現(xiàn)了Dpm1的純化。接下來，利用純化的Dpm1催化Phy-P與GDP-Man形成Phy-P-Man。如圖2(b)的TLC結(jié)果所示，底物Phy-P的比移值（Rf）為0.64（條帶1），在加入Dpm1后Rf變?yōu)?.58（條帶2）。Rf的降低是由于親水性的Man基團(tuán)加入到底物中形成了產(chǎn)物Phy-P-Man導(dǎo)致極性變大，從而在展開劑中遷移率變慢。此結(jié)果說明原核表達(dá)純化的Dpm1活性很高，能完全催化Phy-P生成Phy-P-


本文編號：3250180