酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase,TH）的作用是將L-酪氨酸催化為L(zhǎng)-多巴,而L-多巴是多巴胺的前體物質(zhì)。TH功能異常導(dǎo)致多巴胺合成受損,進(jìn)而引起多種神經(jīng)性疾病的發(fā)生。為了探索TH的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì),文章利用基因工程技術(shù)和生物學(xué)方法,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增TH基因全長(zhǎng),連接至pET-28a載體,構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a/TH,轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株E.coli BL21,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。結(jié)果表明,pET-28a/TH表達(dá)載體構(gòu)建成功,并且TH基因能有效表達(dá),為進(jìn)一步研究該基因的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,43(10)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【部分圖文】：

PCR擴(kuò)增目的片段

用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ切割目的基因和pET-28a載體,酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖2所示,圖2中,M為DNA Marker;1為TH基因PCR產(chǎn)物;2為載體酶切產(chǎn)物。由圖2可知,目的基因和載體均已發(fā)生雙酶切并獲得酶切產(chǎn)物,酶切后的基因和載體條帶清晰、大小正確,證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。將酶切過的基因和載體用T4 DNA連接酶于16 ℃金屬浴中過夜連接,然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入克隆載體E.coli DH5a,用含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板篩選陽性單克隆,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,根據(jù)大腸桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明、小凸起。由此可以判斷平板上生長(zhǎng)的是大腸桿菌,且未被雜菌污染。

將酶切過的基因和載體用T4 DNA連接酶于16 ℃金屬浴中過夜連接,然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入克隆載體E.coli DH5a,用含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB平板篩選陽性單克隆,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,根據(jù)大腸桿菌在瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明、小凸起。由此可以判斷平板上生長(zhǎng)的是大腸桿菌,且未被雜菌污染。挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定并電泳檢測(cè),TH過表達(dá)菌株的菌落的PCR鑒定結(jié)果如圖4所示,圖4中,M為DNA Marker;1～16為單菌落克隆(TH基因PCR產(chǎn)物)。由圖4可知,挑選的大部分單菌落都是陽性菌落,擴(kuò)增后條帶大小也正確。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]酪氨酸羥化酶與神經(jīng)性疾病[J]. 賈藝舒,金文杰,宋巧娟,奚耕思.  中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志. 2016(01)
[2]關(guān)于中國(guó)人口老齡化的過程預(yù)測(cè)[J]. 任大偉.  現(xiàn)代商業(yè). 2015(02)



本文編號(hào)：3239229