研究背景Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（CRISPR）/CRISPR associated protein9（CAS9）是一種來自于細菌的抵御病毒的免疫防御系統(tǒng),后來被開發(fā)成具有高效靶向性和特異性的基因編輯技術(shù),目前廣泛應(yīng)用于基因敲除,定向突變,基因激活,疾病模型構(gòu)建和基因治療等�；贑RISPR/CAS9的人類疾病基因治療的臨床應(yīng)用現(xiàn)已取得重大進展,其中一些也正在進入臨床試驗階段。而作為外源蛋白的CAS9在應(yīng)用到人類疾病治療時的安全風險也一直倍受人關(guān)注。有研究報道在健康人體中發(fā)現(xiàn)了抗CAS9的抗體和抗原反應(yīng)性T細胞,說明CAS9有潛在的免疫風險。此外基因編輯會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性,近幾年多篇研究報道基因編輯可以引起廣泛的染色體缺失,基因重排或突變,并且CRISPR技術(shù)可以激活p53介導(dǎo)的損傷反應(yīng),但具體機制不是十分清楚。大部分研究主要關(guān)注在外源gRNA存在條件下,DNA損傷反應(yīng)的激活,而CAS9在缺乏gRNA時對基因組穩(wěn)定性是否存在影響有待進一步研究。研究方法1.利用Tet-on系統(tǒng)和慢病毒載體分別構(gòu)建... 

【文章來源】：南方醫(yī)科大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１：?Ｈ９中，Ｔｅｔ－ＣＡＳ９在Ｄｏｘｙ處理后２４ｈ、４８ｈ均可以誘導(dǎo)ＤＮＡ損傷通路相關(guān)蛋白的??表達

ｙ?ｉｎ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ??ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ??３．３?ＣＡＳ９能激活ｐ５３信號通路??我們利用Ｑｐｃｒ?qū)Γ穑担车蛲鐾返南掠伟谢虻模恚遥危了竭M行檢測，結(jié)果發(fā)??現(xiàn)ＮＯＸＡ、ｐ２１、ＰＥＲＰ及ＰＵＭＡ水平均明顯升高。說明ＣＡＳ９單獨的過表達能激??活ｐ５３彳Ｓ號通路。??Ｃ??．２?１５，??％??Ｉ．?？ＣＴＬ??ｓ?＂ＣＡＳ９?ｒ??ａ：??ｅ?ｈ?＊??．１５＇?Ｉ?１?＊＊??＾?ｏＷｉ?ｍ???ＮＯＸＡ?ｐ２１?ＰＥＲＰ?ＰＵＭＡ??圖１－３：?ｐ５３凋亡通路下游靶基因ＮＯＸＡ、ｐ２１、ＰＥＲＰ及ＰＵＭＡ的ｍＲＮＡ水平均明顯升尚??２１??

ｎｃｒｅａｓｅｄ．??３．４免疫熒光實驗檢測Ｈ９中過表達ＣＡＳ９對丫?Ｈ２ＡＸ焦點數(shù)量的影響??當ＤＮＡ雙鏈斷裂損傷發(fā)生時，Ｈ２ＡＸ會被迅速磷酸化，并在熒光顯微下形??成一個一個的焦點，是檢測ＤＳＢ的重要標志物。我們通過免疫熒光實驗看到，??與不加Ｄｏｘｙ的對照組相比，Ｄｏｘｙ處理的Ｈ９細胞中ＹＨ２ＡＸ焦點的數(shù)量顯著增??多，并且具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明ＣＡＳ９能使Ｈ２ＡＸ磷酸化水平增高。??ｋ?ＤＡＰＩ?ｙＨ２ＡＸ?ＣＡＳ９?Ｍｅｒｇｅ?Ｂ??■■Ｉ！！，??■■Ｉｋ??圖１－４：免疫熒光實驗顯示Ｈ９中，Ｔｅｔ－ＣＡＳ９誘導(dǎo)ＹＨ２ＡＸ水平增高。Ａ為免疫熒光結(jié)果??圖，Ｂ為重復(fù)三次試驗后的統(tǒng)計圖（＊Ｐ＜０．０５廣Ｐ＜０．０１廣＊Ｐ０．００１）??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４：Ｉｎ?Ｈ９，ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?ｙＨ２ＡＸ?ｆｏｃｉ?ｉｎｃｒｅａｓｅｄ?ｂｙ?ｔｈｅ?ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｔｅｔ－ＣＡＳ９．Ａ?ｉｓ?ｔｈｅ??ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ?ｒｅｓｕｌｔｓ，?Ｂ?ｉｓ?ｔｈｅ?ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ?ｒｅｓｕｌｔｓ?ａｆｔｅｒ?ｒｅｐｅａｔｉｎｇ?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ?ｔｈｒｅｅ??ｔｉｍｅｓ（＊?Ｐ＜０．０５，?＊?＊Ｐ＜０．０１?，＊?＊?＊?Ｐ＜０．００１）??３．５彗星實驗檢測Ｈ９中過表達ＣＡＳ９后ＤＮＡ的損傷情況??彗星實驗可以在單細胞水平上檢測ＤＮＡ損傷的發(fā)生，損傷程度越重，彗尾??越長。阿霉素（Ｄｏｘｏｒｕｂｉｎｃｉｎ，Ｄｏｘ）又名多柔比星，在臨床上用于腫瘤的化??療，它可以嵌入ＤＮＡ堿基對之間，弓｜起細胞ＤＮＡ的損傷。我們通過彗星實驗探??宄ＣＡＳ９對ＤＮＡ損傷的影響，將


本文編號：3229705