三維基因組學(xué)（Three-Dimensional Genomics,3D Genomics）是一門研究染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能的新興學(xué)科,對于解析基因組折疊機(jī)制、基因功能、非編碼DNA元件或基因挖掘等起到重要作用。In situ Hi-C是改良的高通量染色質(zhì)捕獲技術(shù)（High-throughput chromosome conformation capture,Hi-C）,通過保證實(shí)驗(yàn)前期細(xì)胞核的完整性,相比較傳統(tǒng)Hi-C而言能有效減少實(shí)驗(yàn)背景噪聲,提高交互矩陣分辨率。Insitu Hi-C最初是針對人類、小鼠等動物細(xì)胞研究開發(fā)的技術(shù),但由于植物細(xì)胞存在細(xì)胞壁從而難以獲得完整的細(xì)胞核,使其應(yīng)用受到限制。本研究不僅通過溫和的方式去掉細(xì)胞壁,將in situ Hi-C應(yīng)用于模式植物擬南芥中,并針對實(shí)驗(yàn)過程的酶切條件、建庫、細(xì)胞數(shù)量等關(guān)鍵步驟進(jìn)行改進(jìn),優(yōu)化了原始的Hi-C實(shí)驗(yàn)流程。首先,傳統(tǒng)Hi-C技術(shù)使用6位酶切位點(diǎn)限制性內(nèi)切酶（6-位酶）進(jìn)行酶切,酶切位點(diǎn)少,本實(shí)驗(yàn)改用4-位酶能有效增加片段豐富度。其次,在傳統(tǒng)建庫中先捕獲300-500 bp片段再進(jìn)行建庫,有效交互少,本研究改進(jìn)建庫流程,... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２?３Ｃ及其衍生技術(shù)原理圖（ＲｉｓｃａａｎｄＧｒｅｅｎｌｅａｆ２０］５）??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｈｅ?ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ?ｃｏｎｆｏ?

圖２．１擬南芥突變體與野生型幼苗形態(tài)??Ｆｉｇ．?２．１?Ｔｈｅ?ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?ｍｕｔａｎｔ?ａｎｄ?ｗｉｌｄ?ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ?ｏｆ?Ａｒｃｉｂｉｄｏｐｓｉｓ?ｔｈａｌｉａｎａ??試劑耗材??生質(zhì)體獲�。海茫澹欤欤酰欤幔螅澹遥保�?纖維素酶，ＭａｃｅｒｏｚｙｍｅＲ－１０?離析酶，Ｄ－Ｍｉｏｓｈａｒｐ，ＭＥＳ、ＢＳＡ購自Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑??ｉ－Ｃ?實(shí)驗(yàn)：Ｍｂｏｌ、Ｔ４ＤＮＡ?聚合酶、Ｋｌｅｎｏｗ?大片段、Ｔ４ＰＮＫ、Ｔ４ＤＮＡ液?ｌ〇ｘＮＥＢ?ｂｕｆｆｅｒ２、ｌ〇ｘＤＮＡ?ｌｉｇａｓｅ?ｂｕｆｆｅｒ?購自?Ｎｅｗ?Ｅｎｇｌａｎｄ?Ｂｉｏｌａｂ（Ｎ醛、Ｔｒｉｔｏｎ?Ｘ－１００、ＰＥＧ?４０００、ＮａＡｃ?溶液、ｐｒｏｔｅａｓｅ?ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ?ｃｏｃｋｔａｉｌ?購自?ｈ?公司。２０ｍｇ／ｍｌＢＳＡ?購自大連寶生物（ＴａＫａＲａ）公司。ＲＮＡａｓｅ、ｄＮＴＰｓ購自?Ｔｈｅｒｍｏ?公司。ｂｉｏｔｉｎ－１４－ｄＣＴＰ、ＤｙｎａｂｅａｄｓＭｙＯｎｅＳｔｒｅｐｔａｖｉｎ?Ｃｌ?Ｂｅｉｔｒｏｇｅｎ?公司。建庫試劑盒購自?Ｉｌｌｕｍｉｎａ?公司的?ＴｒｕＳｅｑ?ＤＮＡ?Ｓａｍｐｌｅ?Ｐｒｅｐｍｐｕｒｅ?ＸＰ?ｂｅａｄｓ?購自?Ｂｅｃｋｍａｎ?公司。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ?低吸附離心管購自?Ｅｐｐ

?８３．１７ｍｌ??將細(xì)胞懸浮液過４０?ｐｍ細(xì)胞篩，４°Ｃ，１００?ｒ／ｍｉｎ離心５?ｍｉｎ，收集原生質(zhì)體，??用１?ｍｌ?Ｗ５緩沖液混勻，在光學(xué)顯微鏡Ｆ觀察細(xì)胞狀態(tài)，原生質(zhì)體如圖２．２所示。??■??■?？?ｔ、??圖２．２擬南芥葉片原生質(zhì)體的形態(tài)??左側(cè)藍(lán)色箭頭指向的原生質(zhì)體較為飽滿，為實(shí)驗(yàn)較為理想的材料；右側(cè)紅色箭頭指向的為細(xì)胞碎片，若細(xì)胞碎??片較多，會對后續(xù)實(shí)驗(yàn)造成一定影響??Ｆｉｇ．?２．２?Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ?ｏｆ?Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ?ｉｎ?Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ?Ｌｅａｖｅｓ??Ｔｈｅ?ｂｌｕｅ?ａｒｒｏｗ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｌｅｆｔ?ｐｏｉｎｔｅｄ?ｔｏ?ｉｓ?ｆｕｌｌｅｒ?ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ，?ｗｈｉｃｈ?ｉｓ?ａｎ?ｉｄｅａｌ?ｍａｔｅｒｉａｌ?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；?Ｔｈｅ?ｒｅｄ?ａｒｒｏｗ?ｏｎ??ｔｈｅ?ｒｉｇｈｔ?ｐｏｉｎｔｓ?ｔｏ?ｉｓ?ｔｈｅ?ｃｅｌｌ?ｄｅｂｒｉｓ．?Ｉｆ?ｔｈｅｒｅ?ａｒｅ?ｍｏｒｅ?ｃｅｌｌ?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，?ｉｔ?ｗｉｌｌ?ａｆｆｅｃｔ?ｔｈｅ?ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ?ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．??使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，若細(xì)胞較為純凈，則進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，若原生質(zhì)體??雜質(zhì)較多，則將樣品置于冰上靜置ｌ〇ｍｉｎ左右，我們可以看到溶液分層，下層為質(zhì)??量較大的原生質(zhì)體，上層為質(zhì)量較輕的細(xì)胞碎片，吸取上層溶液棄置，用Ｗ５緩沖??液稀釋至ｌｍｌ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]三維基因組學(xué)與精準(zhǔn)生物學(xué)[J]. 張玉波.  中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報. 2018(04)
[2]起航三維基因組學(xué)研究[J]. 李國亮,阮一駿,谷瑞升,杜生明.  科學(xué)通報. 2014(13)



本文編號：3213061