隨著基因組學(xué)、生物信息學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展,大量未知蛋白質(zhì)的功能需要鑒定。融合蛋白標(biāo)簽技術(shù)的發(fā)展,為研究蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)定位、相互作用和分離純化等提供了有效的工具。目前已有許多融合標(biāo)簽系統(tǒng)在重組蛋白質(zhì)表達(dá)中得到廣泛應(yīng)用。但仍存在操作程序復(fù)雜、成本昂貴和周期長(zhǎng)等問(wèn)題。一個(gè)理想的蛋白質(zhì)標(biāo)簽是由基因編碼,在體內(nèi)和體外均能起作用,且提供一個(gè)敏感的分析信號(hào),并不影響甚至促進(jìn)目的蛋白質(zhì)的可溶性表達(dá)。在原核表達(dá)系統(tǒng)中,未經(jīng)改造的綠色熒光蛋白（wild type GFP,wtGFP）的表達(dá)產(chǎn)物大部分是不可溶的,即易形成包涵體。其作為一種報(bào)告基因,以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)廣泛用于基因的表達(dá)與調(diào)控、蛋白質(zhì)的定位、轉(zhuǎn)移及相互作用、信號(hào)傳遞、轉(zhuǎn)染與轉(zhuǎn)化,以及細(xì)胞的分離與純化等研究領(lǐng)域。其折疊易受溫度影響,發(fā)光較弱,應(yīng)用到某些多層植物細(xì)胞中不容易觀(guān)察。后期改造的增強(qiáng)型GFP（enhanced GFP,eGFP）熒光強(qiáng)度得到提高,但在原核表達(dá)系統(tǒng)中其產(chǎn)物也只是少部分可溶。其若作為應(yīng)用標(biāo)簽,不利于可溶性重組蛋白結(jié)構(gòu)、功能和生化性質(zhì)的研究。本實(shí)驗(yàn)以綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）為研... 

【文章來(lái)源】：聊城大學(xué)山東省

【文章頁(yè)數(shù)】：58 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
前言
第一章 緒論
    1.1 大腸桿菌基因表達(dá)系統(tǒng)
        1.1.1 表達(dá)宿主菌
        1.1.2 表達(dá)載體
    1.2 外源蛋白可溶性表達(dá)策略
        1.2.1 寄主菌株的選擇
        1.2.2 載體的選擇
        1.2.3 改變培養(yǎng)參數(shù)
        1.2.4 密碼子優(yōu)化
    1.3 綠色熒光蛋白
        1.3.1 GFP的來(lái)源、結(jié)構(gòu)及發(fā)光機(jī)制
        1.3.2 突變GFP功能研究現(xiàn)狀
        1.3.3 GFP在生物領(lǐng)域的最新應(yīng)用進(jìn)展
第二章 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要儀器設(shè)備
        2.1.4 PCR引物、目的基因合成和測(cè)序
        2.1.5 培養(yǎng)基與主要溶液配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 氯化鈣法制備新鮮的大腸桿菌DH5α感受態(tài)
        2.2.2 目的片段的獲取方法
        2.2.3 酶切反應(yīng)
        2.2.4 純化目的片段與載體
        2.2.5 連接反應(yīng)
        2.2.6 質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
        2.2.7 菌落PCR快速篩選與鑒定重組子
        2.2.8 質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.9 瓊脂糖凝膠電泳分析
        2.2.10 表達(dá)載體pET-eGFP和 p ET-sGFP的構(gòu)建
        2.2.11 熒光強(qiáng)度測(cè)定
        2.2.12 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)
        2.2.13 SDS-PAGE電泳
        2.2.14 sGFP濃度與其熒光強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.1.1 擴(kuò)增基因eGFP
        3.1.2 重組質(zhì)粒p ET-eGFP、pET-sGFP的鑒定
    3.2 熒光蛋白誘導(dǎo)表達(dá)分析
        3.2.1 最佳IPTG誘導(dǎo)濃度鑒定
        3.2.2 熒光強(qiáng)度分析
    3.3 熒光蛋白SGFP的可溶性驗(yàn)證
    3.4 SGFP標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
第四章 討論與展望
    4.1 討論
    4.2 展望
參考文獻(xiàn)
附錄
    縮略語(yǔ)表
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文



本文編號(hào)：3205010