殼寡糖具有多種獨特的生理功能,其活性與聚合度和乙酰化程度有很大關(guān)系。殼聚糖酶能專一性降解殼聚糖制備殼寡糖,催化效率高,產(chǎn)物易于分離,反應(yīng)條件溫和,具有工業(yè)應(yīng)用的價值。已報道的殼聚糖酶大多遵從內(nèi)切型反應(yīng)機制,其水解產(chǎn)物聚合度分布隨機、乙�；稽c復(fù)雜,水解終產(chǎn)物多為殼二糖、殼三糖等短鏈寡糖產(chǎn)物。因此,了解殼聚糖酶產(chǎn)物聚合度差異的分子機制,研究特定聚合度區(qū)間殼寡糖酶法制備具有重要意義。本課題旨在利用X-射線晶體法解析GH46家族殼聚糖酶的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),了解GH46家族殼聚糖酶的底物結(jié)合機制及催化機理,探索殼聚糖酶產(chǎn)物聚合度差異的分子機制。首先,利用X-射線晶體法成功解析了植物內(nèi)生菌Gynuella sunshinyii來源的GH46殼聚糖酶GsCsn46A和解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens來源的GH46殼聚糖酶BaCsn46A與殼四糖、殼五糖的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。闡明了 GH46家族殼聚糖酶與殼寡糖底物（-5—+3位點）的詳細結(jié)合機制,發(fā)現(xiàn)了 GH46家族殼聚糖酶催化凹槽非還原端的3個底物結(jié)合新位點。其次,復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示GsCsn46A的催化凹槽中糖鏈底物均結(jié)合于... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 課題背景及意義
    1.2 國內(nèi)外研究進展
        1.2.2 殼聚糖酶概述
        1.2.3 GH46家族殼聚糖酶研究現(xiàn)狀
    1.3 研究目的、內(nèi)容與技術(shù)路線
        1.3.1 研究目的
        1.3.2 研究內(nèi)容
        1.3.3 技術(shù)路線
第2章 植物內(nèi)生菌來源殼聚糖酶GsCsn46A的蛋白結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析
    2.1 引言
    2.2 材料與儀器
    2.3 實驗方法
        2.3.1 GsCsn46A突變體的構(gòu)建表達
        2.3.2 蛋白含量的測定
        2.3.3 殼聚糖酶活性測定
        2.3.4 GsCsn46A的晶體制備與篩選
        2.3.5 蛋白晶體衍射數(shù)據(jù)的收集和處理
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 GsCsn46A的表達與純化
        2.4.2 GsCsn46A的晶體篩選與優(yōu)化
        2.4.3 GsCsn46A活性中心突變體的構(gòu)建
        2.4.4 GsCsn46A突變體的表達與純化
        2.4.5 GsCsn46A復(fù)合物晶體的篩選與優(yōu)化結(jié)果
        2.4.6 GsCsn46A復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)
    2.5 本章小結(jié)
第3章 解淀粉芽孢桿菌來源殼聚糖酶BaCsn46A的蛋白結(jié)晶與結(jié)構(gòu)解析
    3.1 引言
    3.2 材料與儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 BaCsn46A突變體的構(gòu)建表達
        3.3.2 蛋白含量的測定
        3.3.3 殼聚糖酶活性測定
        3.3.4 BaCsn46A的晶體制備與篩選
        3.3.5 蛋白晶體衍射數(shù)據(jù)的收集和處理
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 BaCsn46A的表達與純化
        3.4.2 BaCsn46A的晶體篩選與優(yōu)化
        3.4.3 殼聚糖酶BaCsn46A活性中心突變體的構(gòu)建
        3.4.4 殼聚糖酶BaCsn46A突變體的表達與純化
        3.4.5 BaCsn46A復(fù)合物晶體的篩選與優(yōu)化
        3.4.6 BaCsn46A復(fù)合物整體結(jié)構(gòu)
    3.5 本章小結(jié)
第4章 GH46家族殼聚糖酶底物結(jié)合機制與催化機理研究
    4.1 引言
    4.2 材料與儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 殼聚糖酶突變體的構(gòu)建表達
        4.3.2 蛋白含量測定
        4.3.3 殼聚糖酶突變體的活性測定
        4.3.4 殼聚糖酶突變體的酶解產(chǎn)物TLC檢測
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 兩種殼聚糖酶的結(jié)構(gòu)對比分析
        4.4.2 GH46家族殼聚糖酶與殼寡糖的相互作用
        4.4.3 GH46殼聚糖酶的底物識別機制與催化機理
        4.4.4 殼聚糖酶突變體的表達與純化
        4.4.5 殼聚糖酶突變體的酶活性測定
        4.4.6 殼聚糖酶突變體的酶解產(chǎn)物分析
        4.4.7 殼聚糖酶突變體的篩選結(jié)果
    4.5 本章小結(jié)
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點
    5.3 展望
參考文獻
致謝
攻讀碩士期間論文及專利發(fā)表情況


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]殼聚糖酶解液的納濾分離技術(shù)研究[J]. 于沛沛,夏文水,仲偉偉,劉曉麗,王斌.  食品與機械. 2018(11)
[3]畢赤酵母表達解淀粉芽孢桿菌殼聚糖酶及其水解制備可控結(jié)構(gòu)殼寡糖[J]. 程功,焦思明,馮翠,賈培媛,任立世,杜昱光.  食品科學(xué). 2019(08)
[4]產(chǎn)殼聚糖酶菌株ncps116發(fā)酵條件優(yōu)化及其酶學(xué)性質(zhì)[J]. 張翔,張彥昊,劉孝永,辛雪,王易芬,陳蕾蕾,周慶新,趙雙枝.  化工進展. 2018(06)
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[6]殼聚糖酶的研究進展[J]. 黃惠莉,朱利平.  食品工業(yè)科技. 2012(06)
[7]殼聚糖酶的分離純化及其特性研究[J]. 任晶,趙華,王虹,王希.  天津科技大學(xué)學(xué)報. 2010(06)
[8]殼聚糖酶的研究進展[J]. 單曉雪,鄭人源,張濤,王玉明.  成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2007(Z1)
[9]青霉菌產(chǎn)殼聚糖酶制備低分子量殼聚糖的研究[J]. 方文建,隋斯光,鄭連英.  中國醫(yī)藥工業(yè)雜志. 2006(02)

博士論文
[1]殼聚糖酶OU01底物結(jié)合與催化機理研究[D]. 律倩倩.中國海洋大學(xué) 2015



本文編號：3202673