特定環(huán)境可改變微藻細(xì)胞內(nèi)碳素分配,促使某一類碳基化合物在細(xì)胞中積累,具體機(jī)制尚不明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn),在氮限制誘導(dǎo)小球藻（Chlorella sp.HN11）油脂積累的過程中,一個銅胺氧化酶基因2（ChlC4O2）表達(dá)上/下調(diào)倍數(shù)最高。銅胺氧化酶（CuAOs）是一類具有多種生理的功能的胺氧化酶,參與植物細(xì)胞分化和對非生物脅迫的反應(yīng),以及哺乳動物脂肪細(xì)胞的形成和分化。然而小球藻CuAOs的生理作用尚未見報導(dǎo)。為進(jìn)一步探明小球藻ChlCAO2在氮限制誘導(dǎo)的油脂積累過程中的功能與作用,本研究設(shè)置了“全氮”、“氮限制”和“氮限制—氮恢復(fù)”三個處理,測定小球藻HN11在0h,24h,48h,72h及96h的CuAOs活性和ChlCAO2基因相對表達(dá)量與油脂積累的相關(guān)性。進(jìn)而通過ChlC4O2超表達(dá)和RNAi載體的遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化藻株,測定轉(zhuǎn)化藻株油脂積累和ChlCAOs酶活等表型,以期探明ChlCAO2在氮限制誘導(dǎo)小球藻油脂積累中的作用。此外,為探明CuAO在油脂積累中的作用是否存在共性,本研究還測定了在“全氮”、“氮限制”和“氮限制—氮恢復(fù)”三個處理下,另外一株小球藻（C.vulgaris ... 

【文章來源】：海南大學(xué)海南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：93 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 微藻應(yīng)用現(xiàn)狀
    1.2 微藻油脂積累的機(jī)制研究進(jìn)展
    1.3 銅胺氧化酶研究進(jìn)展
    1.4 小球藻基因工程的研究進(jìn)展
        1.4.1 小球藻轉(zhuǎn)化方法
        1.4.2 小球藻轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展
    1.5 研究目的與意義
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)藻株、菌株以及質(zhì)粒載體
        2.1.2 培養(yǎng)基
        2.1.3 主要試劑
        2.1.4 儀器設(shè)備
    2.2 小球藻銅胺氧化酶基因ChlCAO2克隆
        2.2.1 藻株培養(yǎng)
        2.2.2 RNA提取
        2.2.3 cDNA第一鏈的合成
        2.2.4 設(shè)計(jì)引物
        2.2.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增
        2.2.6 回收純化PCR產(chǎn)物
        2.2.7 連接轉(zhuǎn)化
        2.2.8 RACE擴(kuò)增
        2.2.9 生物信息學(xué)分析
    2.3 銅胺氧化酶與油脂積累的相關(guān)性分析
        2.3.1 藻株培養(yǎng)
        2.3.2 限氮處理
        2.3.3 幾株微藻的生長量和油脂含量測定
        2.3.4 銅胺氧化酶活性的測定
        2.3.5 銅胺氧化酶基因的表達(dá)
        2.3.6 數(shù)據(jù)分析
    2.4 載體構(gòu)建
        2.4.1 超表達(dá)載體構(gòu)建
        2.4.2 RNAi載體構(gòu)建
    2.5 小球藻轉(zhuǎn)化體系的建立
        2.5.1 抗生素敏感性測定
        2.5.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小球藻
        2.5.3 陽性轉(zhuǎn)化藻株的鑒定
    2.6 ChlCAO2超表達(dá)和RNAi載體的轉(zhuǎn)化
        2.6.1 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
        2.6.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)小球藻轉(zhuǎn)化
    2.7 轉(zhuǎn)基因藻株表型分析
        2.7.1 限氮處理
        2.7.2 生長量和油脂含量測定
        2.7.3 銅胺氧化酶活性和表達(dá)量測定
3 結(jié)果與分析
    3.1 ChlCAO2全長序列的獲得和分析
        3.1.1 ChlCAO2全長序列的獲得
        3.1.2 蛋白質(zhì)序列的同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析
        3.1.3 預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)分析
    3.2 三種綠藻銅胺氧化酶與油脂積累相關(guān)性
        3.2.1 小球藻HN11銅胺氧化酶與油脂積累相關(guān)性
        3.2.2 萊茵衣藻銅胺氧化酶與油脂積累相關(guān)性
        3.2.3 限氮處理小球藻C3銅胺氧化酶油脂與相關(guān)性分析
    3.3 載體構(gòu)建
        3.3.1 超表達(dá)載體構(gòu)建
        3.3.2 RNAi載體構(gòu)建
    3.4 小球藻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立
        3.4.1 小球藻HN11抗生素敏感性測定
        3.4.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)小球藻遺傳轉(zhuǎn)化
    3.5 ChlCAO2在小球藻油脂產(chǎn)生過程中的功能分析
        3.5.1 小球藻超表達(dá)載體和RNAi載體的遺傳轉(zhuǎn)化
        3.5.2 轉(zhuǎn)化藻株表型分析
4 討論
    4.1 氮脅迫對微藻的影響
    4.2 微藻油脂積累與銅胺氧化酶相關(guān)性
5 總結(jié)與展望
參考文獻(xiàn)
縮略詞表
附錄1
附錄2
致謝



本文編號：3197010