桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（Baculovirus expression vector system,BEVS）是目前最具應(yīng)用價(jià)值的商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)之一。昆蟲細(xì)胞作為其中重要組成之一,已有兩個(gè)應(yīng)用最廣泛的商業(yè)化細(xì)胞系,草地貪紋夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢細(xì)胞系Sf9和粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）胚胎細(xì)胞系BTI-Tn-5Bl-4（High Five）。雖然昆蟲細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)比較完善,但是利用BEVS進(jìn)行外源蛋白重組表達(dá)過(guò)程中仍然存在細(xì)胞活力低、細(xì)胞增殖不穩(wěn)定以及細(xì)胞衰退等問(wèn)題,對(duì)后續(xù)重組桿狀病毒制備和外源蛋白表達(dá)非常不利。本課題從昆蟲細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)出發(fā),對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)及重組桿狀病毒制備的基本工藝進(jìn)行了優(yōu)化,并在此基礎(chǔ)上建立了人源甲狀腺過(guò)氧化物酶（Human throid peroxidase,hTPO）和禽腺病毒纖維蛋白2（Fiber-2）的表達(dá)工藝,為優(yōu)化基于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的重組蛋白生產(chǎn)工藝提供了技術(shù)支撐。首先,在100 ml搖瓶中進(jìn)行Sf9和High Five細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)化,從常用的商業(yè)化培養(yǎng)基中篩選出最適培養(yǎng)基IB-905。在此培養(yǎng)基中,確... 

【文章來(lái)源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)
        1.1.1 昆蟲細(xì)胞系
        1.1.2 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基
        1.1.3 昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)
    1.2 桿狀病毒
        1.2.1 桿狀病毒分類
        1.2.2 桿狀病毒感染宿主機(jī)制
    1.3 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)及其應(yīng)用
        1.3.1 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)
        1.3.2 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)發(fā)展
        1.3.3 桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)應(yīng)用
    1.4 本課題研究的內(nèi)容和意義
第2章 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)工藝優(yōu)化
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 Sf9和High Five細(xì)胞液體培養(yǎng)基配制
        2.2.2 昆蟲細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
        2.2.3 昆蟲細(xì)胞計(jì)數(shù)
        2.2.4 昆蟲細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線繪制
        2.2.5 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基篩選
        2.2.6 昆蟲細(xì)胞傳代密度篩選
        2.2.7 昆蟲細(xì)胞搖瓶培養(yǎng)的溶解氧優(yōu)化
        2.2.8 血清添加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 商業(yè)化無(wú)血清培養(yǎng)基篩選
        2.3.2 傳代密度對(duì)昆蟲細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
        2.3.3 溶解氧對(duì)昆蟲細(xì)胞生長(zhǎng)的影響
        2.3.4 血清添加對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及存活率的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第3章 重組桿狀病毒生產(chǎn)工藝優(yōu)化
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 菌種保藏
        3.2.2 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體MultiBac-hTPO構(gòu)建
        3.2.3 重組桿狀病毒的制備
        3.2.4 重組桿狀病毒增殖方式優(yōu)化
        3.2.5 重組桿狀病毒保存條件優(yōu)化
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體MultiBac-hTPO驗(yàn)證
        3.3.2 收獲重組桿狀病毒MultiBac-hTPO
        3.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)方式對(duì)病毒出芽增殖的影響
        3.3.4 重組桿狀病毒保存條件對(duì)病毒滴度的影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第4章 基于BEVS的分泌型蛋白表達(dá)工藝優(yōu)化
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 hTPO表達(dá)測(cè)試
        4.2.2 hTPO表達(dá)的感染復(fù)數(shù)和感染時(shí)間的優(yōu)化
        4.2.3 hTPO在High Five細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞感染密度優(yōu)化
        4.2.4 hTPO親和純化及反應(yīng)原性檢測(cè)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 hTPO在Sf9和High Five兩種細(xì)胞中表達(dá)驗(yàn)證
        4.3.2 hTPO在兩種細(xì)胞中表達(dá)的感染復(fù)數(shù)和感染時(shí)間優(yōu)化
        4.3.3 hTPO在High Five細(xì)胞中表達(dá)的細(xì)胞感染密度優(yōu)化
        4.3.4 hTPO親和純化及反應(yīng)原性檢測(cè)
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第5章 基于BEVS的胞內(nèi)蛋白表達(dá)工藝優(yōu)化
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體MultiBac-Fiber-2構(gòu)建及重組病毒制備
        5.2.2 Fiber-2蛋白表達(dá)及檢測(cè)
        5.2.3 Fiber-2蛋白表達(dá)條件優(yōu)化
        5.2.4 Fiber-2重組蛋白生產(chǎn)及反應(yīng)原性檢測(cè)
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體MultiBac-Fiber-2驗(yàn)證及重組病毒獲得
        5.3.2 Fiber-2在Sf9和High Five兩種細(xì)胞中的表達(dá)
        5.3.3 Fiber-2在兩種細(xì)胞中表達(dá)的MOI和感染時(shí)間優(yōu)化
        5.3.4 High Five細(xì)胞表達(dá)Fiber-2細(xì)胞感染密度優(yōu)化
        5.3.5 Fiber-2蛋白反應(yīng)原性及效價(jià)測(cè)定
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第6章 總結(jié)與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Sf9昆蟲細(xì)胞懸浮培養(yǎng)工藝研究[J]. 李偉,秦紅剛,張萍,漆世華,朱薇,王威,謝紅玲,溫文生,吳玉石.  中國(guó)獸藥雜志. 2012(08)
[2]昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的研究進(jìn)展[J]. 李穎,孫興魯,浦冠勤.  中國(guó)蠶業(yè). 2010(04)
[3]昆蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)和建立技術(shù)[J]. 張寰,張永安,秦啟聯(lián),王玉珠,曲良建,李瑄,苗麟,殷珍仙,張愛君,溫發(fā)園.  昆蟲學(xué)報(bào). 2007(08)
[4]葡萄糖的添加對(duì)昆蟲細(xì)胞Sf21懸浮生長(zhǎng)的影響[J]. 李文青,肖成祖,黃子才,陳昭烈.  生物工程學(xué)報(bào). 1996(01)



本文編號(hào)：3179380