桿狀病毒表達系統(tǒng)（Baculovirus expression vector system,BEVS）是目前最具應用價值的商業(yè)化表達系統(tǒng)之一。昆蟲細胞作為其中重要組成之一,已有兩個應用最廣泛的商業(yè)化細胞系,草地貪紋夜蛾（Spodoptera frugiperda）卵巢細胞系Sf9和粉紋夜蛾（Trichoplusia ni）胚胎細胞系BTI-Tn-5Bl-4（High Five）。雖然昆蟲細胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)比較完善,但是利用BEVS進行外源蛋白重組表達過程中仍然存在細胞活力低、細胞增殖不穩(wěn)定以及細胞衰退等問題,對后續(xù)重組桿狀病毒制備和外源蛋白表達非常不利。本課題從昆蟲細胞搖瓶培養(yǎng)出發(fā),對細胞培養(yǎng)及重組桿狀病毒制備的基本工藝進行了優(yōu)化,并在此基礎上建立了人源甲狀腺過氧化物酶（Human throid peroxidase,hTPO）和禽腺病毒纖維蛋白2（Fiber-2）的表達工藝,為優(yōu)化基于桿狀病毒表達系統(tǒng)的重組蛋白生產(chǎn)工藝提供了技術(shù)支撐。首先,在100 ml搖瓶中進行Sf9和High Five細胞的懸浮培養(yǎng)工藝優(yōu)化,從常用的商業(yè)化培養(yǎng)基中篩選出最適培養(yǎng)基IB-905。在此培養(yǎng)基中,確... 

【文章來源】：華東理工大學上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：69 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 文獻綜述
    1.1 昆蟲細胞培養(yǎng)
        1.1.1 昆蟲細胞系
        1.1.2 昆蟲細胞培養(yǎng)基
        1.1.3 昆蟲細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)
    1.2 桿狀病毒
        1.2.1 桿狀病毒分類
        1.2.2 桿狀病毒感染宿主機制
    1.3 桿狀病毒表達系統(tǒng)及其應用
        1.3.1 桿狀病毒表達系統(tǒng)
        1.3.2 桿狀病毒表達系統(tǒng)發(fā)展
        1.3.3 桿狀病毒表達系統(tǒng)應用
    1.4 本課題研究的內(nèi)容和意義
第2章 昆蟲細胞培養(yǎng)工藝優(yōu)化
    2.1 實驗材料
    2.2 實驗方法
        2.2.1 Sf9和High Five細胞液體培養(yǎng)基配制
        2.2.2 昆蟲細胞凍存和復蘇
        2.2.3 昆蟲細胞計數(shù)
        2.2.4 昆蟲細胞的生長曲線繪制
        2.2.5 昆蟲細胞培養(yǎng)基篩選
        2.2.6 昆蟲細胞傳代密度篩選
        2.2.7 昆蟲細胞搖瓶培養(yǎng)的溶解氧優(yōu)化
        2.2.8 血清添加對細胞生長的影響
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 商業(yè)化無血清培養(yǎng)基篩選
        2.3.2 傳代密度對昆蟲細胞生長的影響
        2.3.3 溶解氧對昆蟲細胞生長的影響
        2.3.4 血清添加對細胞生長及存活率的影響
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第3章 重組桿狀病毒生產(chǎn)工藝優(yōu)化
    3.1 實驗材料
    3.2 實驗方法
        3.2.1 菌種保藏
        3.2.2 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體MultiBac-hTPO構(gòu)建
        3.2.3 重組桿狀病毒的制備
        3.2.4 重組桿狀病毒增殖方式優(yōu)化
        3.2.5 重組桿狀病毒保存條件優(yōu)化
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體MultiBac-hTPO驗證
        3.3.2 收獲重組桿狀病毒MultiBac-hTPO
        3.3.3 細胞培養(yǎng)方式對病毒出芽增殖的影響
        3.3.4 重組桿狀病毒保存條件對病毒滴度的影響
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第4章 基于BEVS的分泌型蛋白表達工藝優(yōu)化
    4.1 實驗材料
    4.2 實驗方法
        4.2.1 hTPO表達測試
        4.2.2 hTPO表達的感染復數(shù)和感染時間的優(yōu)化
        4.2.3 hTPO在High Five細胞中表達的細胞感染密度優(yōu)化
        4.2.4 hTPO親和純化及反應原性檢測
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 hTPO在Sf9和High Five兩種細胞中表達驗證
        4.3.2 hTPO在兩種細胞中表達的感染復數(shù)和感染時間優(yōu)化
        4.3.3 hTPO在High Five細胞中表達的細胞感染密度優(yōu)化
        4.3.4 hTPO親和純化及反應原性檢測
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第5章 基于BEVS的胞內(nèi)蛋白表達工藝優(yōu)化
    5.1 實驗材料
    5.2 實驗方法
        5.2.1 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體MultiBac-Fiber-2構(gòu)建及重組病毒制備
        5.2.2 Fiber-2蛋白表達及檢測
        5.2.3 Fiber-2蛋白表達條件優(yōu)化
        5.2.4 Fiber-2重組蛋白生產(chǎn)及反應原性檢測
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體MultiBac-Fiber-2驗證及重組病毒獲得
        5.3.2 Fiber-2在Sf9和High Five兩種細胞中的表達
        5.3.3 Fiber-2在兩種細胞中表達的MOI和感染時間優(yōu)化
        5.3.4 High Five細胞表達Fiber-2細胞感染密度優(yōu)化
        5.3.5 Fiber-2蛋白反應原性及效價測定
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第6章 總結(jié)與展望
    6.1 總結(jié)
    6.2 展望
參考文獻
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Sf9昆蟲細胞懸浮培養(yǎng)工藝研究[J]. 李偉,秦紅剛,張萍,漆世華,朱薇,王威,謝紅玲,溫文生,吳玉石.  中國獸藥雜志. 2012(08)
[2]昆蟲桿狀病毒殺蟲劑的研究進展[J]. 李穎,孫興魯,浦冠勤.  中國蠶業(yè). 2010(04)
[3]昆蟲細胞系的培養(yǎng)和建立技術(shù)[J]. 張寰,張永安,秦啟聯(lián),王玉珠,曲良建,李瑄,苗麟,殷珍仙,張愛君,溫發(fā)園.  昆蟲學報. 2007(08)
[4]葡萄糖的添加對昆蟲細胞Sf21懸浮生長的影響[J]. 李文青,肖成祖,黃子才,陳昭烈.  生物工程學報. 1996(01)



本文編號：3179380