本研究旨在構(gòu)建含小鼠PKM1基因的慢病毒過表達載體,篩選穩(wěn)定過表達PKM1的C₂C₁₂細(xì)胞株,初步檢測PKM1對細(xì)胞糖酵解的影響。提取小鼠背最長肌總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用"Golden20Gate"法構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的PKM1表達載體并轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進行慢病毒包裝并檢測慢病毒滴度。轉(zhuǎn)染C₂C₁₂細(xì)胞并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,根據(jù)載體攜帶的抗性基因puro,用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株。通過qPCR和Western20Blot從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測目的基因的表達。通過測定細(xì)胞培養(yǎng)基的pH、乳酸含量以及葡萄消耗量檢測PKM1對糖酵解的影響。結(jié)果表明小鼠PKM1基因慢病毒載體構(gòu)建成功,慢病毒滴度為3.4×10⁸20TU/mL。慢病毒侵染靶細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)為30,篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株所用嘌呤霉素的最佳濃度為1.2μg/mL。顯微鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效果良好,熒光率達80%以上。過表達組中FLAG-PKM1的mRNA表達量約是空載體組的9.4萬倍。FLAG-PKM1融合蛋白成功在宿主細(xì)胞內(nèi)表達。與... 

【文章來源】：食品工業(yè)科技. 2020,41(10)北大核心

【文章頁數(shù)】：8 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料與儀器
    1.2 實驗方法
        1.2.1 Golden Gate法構(gòu)建表達載體
            1.2.1.1 總RNA提取
            1.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈
            1.2.1.3 引物設(shè)計
            1.2.1.4 目的片段的擴增回收
            1.2.1.5 目的片段與T載體連接
            1.2.1.6 加酶切位點
            1.2.1.7 入門載體的構(gòu)建
            1.2.1.8 表達載體構(gòu)建
        1.2.2 慢病毒包裝
            1.2.2.1 293T細(xì)胞培養(yǎng)
            1.2.2.2 轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞
            1.2.2.3 慢病毒收集濃縮
            1.2.2.4 qPCR法測定慢病毒滴度
        1.2.3 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
            1.2.3.1 最佳MOI值的確定
            1.2.3.2 最佳抗生素篩選濃度的確定
        1.2.4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選
            1.2.4.1 細(xì)胞準(zhǔn)備
            1.2.4.2 病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)
            1.2.4.3 細(xì)胞純化
        1.2.5 RT-qPCR檢測目的基因mRNA表達量
            1.2.5.1 細(xì)胞總RNA提取
            1.2.5.2 總RNA反轉(zhuǎn)錄
            1.2.5.3 熒光定量PCR
        1.2.6 Western Blot檢測目的蛋白的表達量
            1.2.6.1 誘導(dǎo)細(xì)胞分化
            1.2.6.2 蛋白提取
            1.2.6.3 SDS-PAGE電泳
            1.2.6.4 轉(zhuǎn)膜
            1.2.6.5 封閉
            1.2.6.6 抗體孵育及顯色成像
        1.2.7 細(xì)胞培養(yǎng)基的pH和乳酸含量測定
            1.2.7.1 pH測定
            1.2.7.2 乳酸含量測定
        1.2.8 C2C12細(xì)胞的葡萄糖消耗試驗
    1.3 數(shù)據(jù)處理
2 結(jié)果與分析
    2.1 總RNA完整性和純度檢測
    2.2 目的片段擴增
    2.3 表達載體的酶切鑒定
    2.4 慢病毒滴度測定
    2.5 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化
    2.6 qPCR檢測目的基因mRNA表達量
    2.7 Western Blot檢測目的蛋白的表達量
    2.8 細(xì)胞培養(yǎng)基的pH和乳酸含量以及葡萄糖消耗量測定
3 結(jié)論


【參考文獻】：
期刊論文
[1]PKM220promotes20reductive20glutamine20metabolism[J]. Miao Liu,Yuanyuan Wang,Yuxia Ruan,Changsen Bai,Li Qiu,Yanfen Cui,Guoguang Ying,Binghui Li.  Cancer Biology & Medicine. 2018(04)



本文編號：3177674