水對(duì)于植物生長(zhǎng)是必須的,缺水條件下,植物生長(zhǎng)速率明顯降低。滲透感受器OSCA1是植物感受干旱的非選擇性陽離子通道,但目前并不清楚OSCA1在高滲脅迫響應(yīng)過程中是如何被調(diào)控的,以及OSCA家族其它成員的生物學(xué)功能。研究OSCA1蛋白結(jié)構(gòu)的功能域,有助于我們理解OSCA1感受刺激的機(jī)理。本課題通過酵母雙雜技術(shù)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證OSIP-CM是OSCA1的互作因子,并通過HEK20293T細(xì)胞異源表達(dá)OSCA1和OSIP-CM,發(fā)現(xiàn)OSIP-CM會(huì)反饋抑制OSCA1的離子通道活性,對(duì)高滲刺激產(chǎn)生的鈣信號(hào)產(chǎn)生反饋抑制。為人工改造OSCA1的通道活性以提高OSCA1感受脅迫的靈敏度,增強(qiáng)植物抗旱節(jié)水能力,我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以研究OSCA1與OSIP-CM互作的功能區(qū)域和關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)。通過對(duì)OSIP-CM結(jié)合位點(diǎn)和OSCA1蛋白結(jié)構(gòu)的分析,我們定點(diǎn)突變了OSCA1中三個(gè)位點(diǎn)氨基酸,酵母雙雜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,三個(gè)位點(diǎn)單獨(dú)突變后,osca1仍會(huì)與OSIP-CM發(fā)生相互作用,說明OSCA1與OSIP-CM存在多個(gè)結(jié)合位點(diǎn),接下來我們將設(shè)計(jì)多個(gè)位點(diǎn)突變進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定OSCA1的關(guān)鍵功能區(qū)域,從而人工改造OSC... 

【文章來源】：杭州師范大學(xué)浙江省

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstracts
縮寫表
1 引言
    1.1 植物體內(nèi)鈣信號(hào)研究
        1.1.1 植物對(duì)鈣的需求
        1.1.2 鈣在植物中的運(yùn)輸系統(tǒng)
    1.2干旱脅迫感受器——OSCA1
        1.2.1 OSCA1基因的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 OSCA1蛋白結(jié)構(gòu)
        1.2.3 OSCA1基因的功能
        1.2.4 OSCA基因家族概述
    1.3 鈣相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白
        1.3.1 鈣調(diào)素
        1.3.2 鈣調(diào)磷酸脂酶B類蛋白
        1.3.3 Ca~(2+)依賴性蛋白激酶
    1.4 花粉管中鈣信號(hào)
        1.4.1 花粉管概述
        1.4.2 花粉管尖端生長(zhǎng)中的鈣信號(hào)
        1.4.3 花粉管極性生長(zhǎng)中重要信號(hào)傳導(dǎo)途徑
    1.5 研究方向與計(jì)劃
2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 OSIP-CM介導(dǎo)干旱感受器OSCA1 的反饋調(diào)節(jié)
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料
            2.1.1.1 植物材料
            2.1.1.2 菌株與載體
            2.1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1.2.1 PCR擴(kuò)增OSCA1 基因
            2.1.2.2 從瓊脂糖凝膠中純化回收DNA
            2.1.2.3 構(gòu)建T載體
            2.1.2.4 質(zhì)�；厥�
            2.1.2.5 DNA和 Cub載體酶切回收
            2.1.2.6 目的片段連接轉(zhuǎn)化進(jìn)終載體Cub
            2.1.2.7 酵母雙雜驗(yàn)證OSCA1與OSIP-CM存在相互作用
            2.1.2.8 Bi FC驗(yàn)證OSCA1與OSIP-CM存在相互作用
            2.1.2.9 HEK293T細(xì)胞異源表達(dá)
            2.1.2.10 預(yù)測(cè)OSCA1與OSIP-CM的結(jié)合位點(diǎn)
            2.1.2.11 OSCA1全長(zhǎng)定點(diǎn)突變
            2.1.2.12 構(gòu)建Cub載體,酵母雙雜交
    2.2 擬南芥中OSCA蛋白家族成員功能研究
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.2.2.1 花粉培養(yǎng)基配置
            2.2.2.2 不同滲透條件下花粉體外培養(yǎng)
            2.2.2.3 檢測(cè)花粉粒活性
            2.2.2.4 檢測(cè)種子胚胎育性
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3.1 OSIP-CM介導(dǎo)干旱感受器OSCA1 的反饋調(diào)節(jié)
        3.1.1 酵母雙雜驗(yàn)證OSCA1與OSIP-CM相互作用
        3.1.2 Bi FC驗(yàn)證OSCA1與OSIP-CM相互作用
        3.1.3 在HEK293T細(xì)胞中OSIP-CM對(duì) OSCA1 的作用
        3.1.4 預(yù)測(cè)OSCA1與OSIP-CM的結(jié)合位點(diǎn)
        3.1.5 OSCA1全長(zhǎng)定點(diǎn)突變酵母雙雜結(jié)果
        3.1.6 討論
    3.2 擬南芥中OSCA蛋白家族成員功能研究
        3.2.1 OSCA D和 OSCA F影響花粉粒萌發(fā)
        3.2.2 OSCA D和 OSCA F參與調(diào)控花粉管的生長(zhǎng)
        3.2.3 OSCA D和 OSCA F同時(shí)作用于胚胎發(fā)育
        3.2.4 討論
參考文獻(xiàn)


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]小麥TaOSCA1.4基因的克隆、標(biāo)記開發(fā)和功能分析[D]. 呂廣德.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015



本文編號(hào)：3176723