2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconic acid,2KGA）是抗氧化劑D-異抗壞血酸及其鈉鹽合成的前體物質(zhì),被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化工等領(lǐng)域。膜結(jié)合葡萄糖酸脫氫酶（gluconate dehydrogenase,GADH）是2KGA生物合成過程中一種重要的氧化還原酶,為提高2KGA的生產(chǎn)效率,有必要對其進(jìn)行深入研究。本論文以2KGA生產(chǎn)菌株粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）JUIM03為研究材料,利用Triton X-114兩相分離技術(shù)和層析技術(shù)從該菌株中分離純化膜結(jié)合GADH,隨后采用SDS-PAGE、可見光吸收光譜和MALDI-TOF-MS技術(shù)對純化的蛋白進(jìn)行分析,同時利用高效液相色譜和紅外光譜技術(shù)對其催化氧化葡萄糖酸的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定,并系統(tǒng)研究膜結(jié)合GADH的酶學(xué)特性。在此基礎(chǔ)上,采用LA-PCR（long and accurate polymerase chain reaction）技術(shù)克隆膜結(jié)合GADH的基因,并利用生物信息學(xué)在線分析工具和相關(guān)軟件明確膜結(jié)合GADH蛋白的生物學(xué)信息。主要研究結(jié)果如下:（1）通過超聲破碎細(xì)胞、Triton... 

【文章來源】：江蘇大學(xué)江蘇省

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
英文縮略表
第一章 緒論
    1.1 粘質(zhì)沙雷氏菌的相關(guān)研究進(jìn)展
        1.1.1 粘質(zhì)沙雷氏菌簡介
        1.1.2 粘質(zhì)沙雷氏菌的葡萄糖代謝及其發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用
        1.1.3 粘質(zhì)沙雷氏菌的2KGA合成代謝
    1.2 FAD依賴性膜結(jié)合葡萄糖酸脫氫酶相關(guān)研究進(jìn)展
        1.2.1 FAD依賴性膜結(jié)合GADH的來源與結(jié)構(gòu)
        1.2.2 FAD依賴性膜結(jié)合GADH的純化
        1.2.3 膜結(jié)合GADH的克隆表達(dá)
    1.3 膜蛋白概述
        1.3.1 膜蛋白的定義與分類
        1.3.2 TritonX-114 兩相分離膜蛋白
        1.3.3 膜蛋白的純化技術(shù)
    1.4 立題背景及意義
    1.5 研究的主要內(nèi)容
第二章 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的分離純化與初步鑒定
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 實驗材料與儀器設(shè)備
        2.1.3 培養(yǎng)基
    2.2 實驗方法
        2.2.1 粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03 細(xì)胞生長曲線的測定
        2.2.2 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的分離純化
        2.2.3 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的電泳檢測
        2.2.4 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的吸收光譜分析
        2.2.5 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的 MALDI-TOF-MS分析
        2.2.6 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成產(chǎn)物的分析
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 粘質(zhì)沙雷氏菌JUIM03 生長曲線的變化分析
        2.3.2 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的分離純化
        2.3.3 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的 SDS-PAGE分析
        2.3.4 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合膜結(jié)合GADH在可見光區(qū)的吸收光譜分析
        2.3.5 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的 MALDI-TOF-MS分析
        2.3.6 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH催化GA形成產(chǎn)物的鑒定
    2.4 本章小結(jié)
第三章 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的酶學(xué)性質(zhì)
    3.1 實驗材料和儀器
        3.1.1 主要試劑和材料
        3.1.2 主要儀器與設(shè)備
    3.2 實驗方法
        3.2.1 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的制備及活性測定
        3.2.2 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH最適反應(yīng)溫度的測定
        3.2.3 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的熱穩(wěn)定性測定
        3.2.4 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的最適反應(yīng)pH及 pH穩(wěn)定性測定
        3.2.5 金屬離子對粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH催化反應(yīng)活性的影響
        3.2.6 變性劑和EDTA對粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH催化活性的影響
        3.2.7 有機酸對粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH催化活性的影響
        3.2.8 有機溶劑對粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH催化活性的影響
        3.2.9 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的底物特異性實驗
        3.2.10 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH催化反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)的測定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的最適反應(yīng)溫度
        3.3.2 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的熱穩(wěn)定性
        3.3.3 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的最適反應(yīng)pH
        3.3.4 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的 pH穩(wěn)定性
        3.3.5 金屬離子對粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH活性的影響
        3.3.6 變性劑和EDTA對粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH活性的影響
        3.3.7 有機酸對粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH催化活性的影響
        3.3.8 有機溶劑對粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH活性的影響
        3.3.9 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的底物特異性
        3.3.10 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH的酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)
        3.3.11 不同微生物來源的膜結(jié)合 GADH 的比較
    3.4 本章小結(jié)
第四章 粘質(zhì)沙雷氏菌膜結(jié)合GADH基因的克隆與生物信息學(xué)分析
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 生化試劑與溶液
        4.1.3 主要儀器與設(shè)備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA的提取
        4.2.2 PCR引物的設(shè)計與合成
        4.2.3 目的基因片段的擴增與回收
        4.2.4 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備
        4.2.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.2.6 大腸桿菌JM109 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
        4.2.7 重組質(zhì)粒的驗證
        4.2.8 粘質(zhì)沙雷氏菌gad操縱子的生物信息學(xué)分析
    4.3 實驗結(jié)果及分析
        4.3.1 粘質(zhì)沙雷氏菌gad操縱子的克隆
        4.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證
        4.3.3 粘質(zhì)沙雷氏菌gad操作子結(jié)構(gòu)基因的組分分析
        4.3.4 粘質(zhì)沙雷氏菌gad操作子中各結(jié)構(gòu)基因的生物信息學(xué)分析
    4.4 本章小結(jié)
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 主要結(jié)論
    5.2 存在問題與展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
[1]變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸激酶基因的克隆表達(dá)及其在葡萄糖代謝中的作用研究[D]. 何小用.江蘇大學(xué) 2017
[2]變形假單胞菌2-酮基葡萄糖酸代謝調(diào)控蛋白PtxS的克隆表達(dá)、分離純化及鑒定[D]. 張曉飛.江蘇大學(xué) 2016
[3]2-酮基-D-葡萄糖酸產(chǎn)生菌膜結(jié)合葡萄糖脫氫酶的分離純化及性質(zhì)[D]. 薛慶.河北師范大學(xué) 2015



本文編號：3175058