黑曲霉是工業(yè)生產上的重要模式菌株,其啟動子活性對其生產效率有重要影響;細胞色素P450是調控菌體能量代謝、細胞生長和各種代謝產物合成的關鍵酶.通過對細胞色素P450基因啟動子區(qū)域（PP450）的克隆、結構分析和功能鑒定,為P450基因的表達調節(jié)研究和P450啟動子的應用提供基礎.從黑曲霉基因組克隆出細胞色素P450基因（An11g01980）的上游片段PP450,連接到pGEM-T載體進行測序,用啟動子分析網站GPMiner和EMBOSS分析PP450片段的啟動子功能元件,結果顯示:PP450片段的-864～-106 bp處有一段長為759 bp的CpG區(qū)域,含有2個TATA盒、6個CAAT盒、2個GC盒和1個可能的AmyR結合位點.構建含PP450啟動子的啟動子–報告基因表達載體p PZP-PP450并轉化黑曲霉,通過熒光強度檢測啟動子功能,結果表明該啟動子是一個組成型啟動子,但添加沃氏氧化物后啟動子表達強度明顯增強,推測該啟動子區(qū)域可能含有沃氏氧化物相關的反應元件或增強子. 

【文章來源】：天津科技大學學報. 2020,35(06)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

PP450片段的擴增

將PP450片段連接到p GEM-T載體上構建出p T-PP450并進行測序．測序結果表明，克隆的PP450序列長1 080 bp，與報道的An11g01980基因上游序列完全一致．用啟動子分析網站GPMiner和EMBOSS對PP450片段進行結構分析，結果如圖2所示，其中陰影部分為預測的啟動子元件，TSS為轉錄起始位點．在翻譯起始位點上游43 bp處為可能的轉錄起始位點(TSS)，在TSS上游有兩個可能的TATA盒，它們與TATA盒的保守序列TATAAAA并不完全一致但高度相似；PP450上還有6個可能的CAAT盒，其中2個CAAT盒與其保守序列基本一致，其余4個CAAT盒與其保守序列也高度相似；另外，還有2個GC盒在PP450的負鏈上；PP450片段的-864～-106 bp處有一段長為759 bp的Cp G區(qū)域．特別有趣的是，在PP450上還發(fā)現(xiàn)轉錄因子Amy R的1個可能的結合位點序列CCGTATATGGTCCG，這個序列是否真的能結合轉錄因子Amy R并參與轉錄調節(jié)，還需要實驗證實．PP450啟動子元件的具體信息見表1.

將p T-PP450載體與p PZP-Pepo1載體均經HindⅢ、AvrⅡ雙酶切和連接后構建成所需要的目的載體p PZP-PP450，轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞后，經Kana抗性篩選，挑取陽性轉化子提質粒并用HindⅢ和SpeⅠ進行雙酶切驗證，結果如圖3所示．條帶與理論大小(10 000 bp和3 000 bp)一致，說明目的載體p PZP-PP450構建成功．2.3 黑曲霉的轉化和驗證

【參考文獻】：
期刊論文
[1]一種用于PCR擴增的絲狀真菌DNA快速提取方法[J]. 潘力,崔翠,王斌.  微生物學通報. 2010(03)

博士論文
[1]白腐真菌細胞色素P450轉化難降解有機物的功能研究[D]. 寧大亮.清華大學 2009

碩士論文
[1]少孢節(jié)叢孢菌Aoz1基因及其啟動子的研究[D]. 王新芳.內蒙古農業(yè)大學 2018
[2]玉米黑粉菌cyp51基因上游啟動子克隆及功能鑒定[D]. 黎晨.華中師范大學 2010



本文編號：3143822