發(fā)布時(shí)間：2021-04-17 17:09

　　黑曲霉是工業(yè)生產(chǎn)上的重要模式菌株,其啟動子活性對其生產(chǎn)效率有重要影響;細(xì)胞色素P450是調(diào)控菌體能量代謝、細(xì)胞生長和各種代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶.通過對細(xì)胞色素P450基因啟動子區(qū)域（PP450）的克隆、結(jié)構(gòu)分析和功能鑒定,為P450基因的表達(dá)調(diào)節(jié)研究和P450啟動子的應(yīng)用提供基礎(chǔ).從黑曲霉基因組克隆出細(xì)胞色素P450基因（An11g01980）的上游片段PP450,連接到pGEM-T載體進(jìn)行測序,用啟動子分析網(wǎng)站GPMiner和EMBOSS分析PP450片段的啟動子功能元件,結(jié)果顯示:PP450片段的-864～-106 bp處有一段長為759 bp的CpG區(qū)域,含有2個TATA盒、6個CAAT盒、2個GC盒和1個可能的AmyR結(jié)合位點(diǎn).構(gòu)建含PP450啟動子的啟動子–報(bào)告基因表達(dá)載體p PZP-PP450并轉(zhuǎn)化黑曲霉,通過熒光強(qiáng)度檢測啟動子功能,結(jié)果表明該啟動子是一個組成型啟動子,但添加沃氏氧化物后啟動子表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng),推測該啟動子區(qū)域可能含有沃氏氧化物相關(guān)的反應(yīng)元件或增強(qiáng)子. 

【文章來源】：天津科技大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,35(06)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

PP450片段的擴(kuò)增

將PP450片段連接到p GEM-T載體上構(gòu)建出p T-PP450并進(jìn)行測序．測序結(jié)果表明，克隆的PP450序列長1 080 bp，與報(bào)道的An11g01980基因上游序列完全一致．用啟動子分析網(wǎng)站GPMiner和EMBOSS對PP450片段進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖2所示，其中陰影部分為預(yù)測的啟動子元件，TSS為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)．在翻譯起始位點(diǎn)上游43 bp處為可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)，在TSS上游有兩個可能的TATA盒，它們與TATA盒的保守序列TATAAAA并不完全一致但高度相似；PP450上還有6個可能的CAAT盒，其中2個CAAT盒與其保守序列基本一致，其余4個CAAT盒與其保守序列也高度相似；另外，還有2個GC盒在PP450的負(fù)鏈上；PP450片段的-864～-106 bp處有一段長為759 bp的Cp G區(qū)域．特別有趣的是，在PP450上還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Amy R的1個可能的結(jié)合位點(diǎn)序列CCGTATATGGTCCG，這個序列是否真的能結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子Amy R并參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，還需要實(shí)驗(yàn)證實(shí)．PP450啟動子元件的具體信息見表1.

將p T-PP450載體與p PZP-Pepo1載體均經(jīng)HindⅢ、AvrⅡ雙酶切和連接后構(gòu)建成所需要的目的載體p PZP-PP450，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)Kana抗性篩選，挑取陽性轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒并用HindⅢ和SpeⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3所示．條帶與理論大小(10 000 bp和3 000 bp)一致，說明目的載體p PZP-PP450構(gòu)建成功．2.3 黑曲霉的轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]一種用于PCR擴(kuò)增的絲狀真菌DNA快速提取方法[J]. 潘力,崔翠,王斌.  微生物學(xué)通報(bào). 2010(03)

博士論文
[1]白腐真菌細(xì)胞色素P450轉(zhuǎn)化難降解有機(jī)物的功能研究[D]. 寧大亮.清華大學(xué) 2009

碩士論文
[1]少孢節(jié)叢孢菌Aoz1基因及其啟動子的研究[D]. 王新芳.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018
[2]玉米黑粉菌cyp51基因上游啟動子克隆及功能鑒定[D]. 黎晨.華中師范大學(xué) 2010



本文編號：3143822