核酸分析檢測(cè)對(duì)生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、人類健康具有重要意義。傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）依賴熱循環(huán)儀,不適合在偏遠(yuǎn)、貧窮、沒(méi)有相關(guān)儀器的地方進(jìn)行檢測(cè)。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)不依賴于精良設(shè)備,在現(xiàn)場(chǎng)和臨床快速診斷中展示了良好的應(yīng)用前景。然而,當(dāng)前等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在靈敏度、特異性和適用范圍方面仍存在著一些問(wèn)題。CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種源自原核生物獲得性免疫系統(tǒng)的基因定點(diǎn)編輯技術(shù),自發(fā)現(xiàn)以來(lái)吸引了大量科研關(guān)注,近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于臨床核酸分析檢測(cè)及生物傳感技術(shù)。本文利用CRISPR/Cas蛋白獨(dú)特的核酸切割活性,分別開(kāi)發(fā)了 microRNA快速檢測(cè)和核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)新方法。首先,我們利用Cas12a蛋白的反式切割活性,開(kāi)發(fā)了一種多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)方法應(yīng)用于microRNA（miRNA）特異性檢測(cè)。靶標(biāo)miRNA存在時(shí),RNA連接酶引發(fā)連接反應(yīng)生成包含T7啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模板,T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄合成大量含有crRNA和8-17E脫氧核酶底物的RNA序列,8-17E脫氧核酶特異性切割RNA序列生成crRNA和與靶標(biāo)miRNA序列相同的RNA。crRNA與Cas12a結(jié)合后,反應(yīng)體系中游離的雙鏈DNA分子特異性激... 

【文章來(lái)源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．１血液中的無(wú)細(xì)胞核酸［６１

?°Ｃ）來(lái)生成靶標(biāo)。??Ａ?Ｕ＿－ＵＬ－＿－Ｌ二二丄ｍ＿＿＿＝ａｇ??Ｉ??ｒ—?，：３］、．七?＊???????■?ｆｔｌｎａｍ?ｒｕ？ｕｈＮＨ?ｍｈＩ??二〈一??ｒ?ｓｉＨｉＭａＢＭａＢａｉａｉａＢＭａａａａａｉａａＢａａＢｉＢＢＢｉｉａｉａｉＭａ＊?？？??Ｉ?Ｍｍ？ｉ?ｎｔＭａｔＭＭ?ｍ４??．－???＾一?＿??？?１???■％?＾??暴??暴??暴?ｒＭ?ｈｆａ—?ｒ％ｌ?ｉｒ??Ｌｕ口??”?Ｉ—??——，?———??圖１．２?ＳＤＡ反應(yīng)的原理圖間。??Ｆｉｇ．?１．２?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ＳＤＡ?ｒｅａｃｔｉｏｎ．??

Ｓｒ－—?＊■卞?Ｙ??｜?ｒ?ＭＭｗｔ??？ｉ？?ｎ?ｎ?ｍ＞?ｍ＞?ｍ??：：５—ｓ—ｇ—?■！?？■■■－?｜＂？￣?？＊??士、？“?１?＂?Ｎｒ??？．Ｍ?ｆｔ?ｎ?Ｍｉ?Ｍ＞?Ｍｌ??ｉ?ａ—ｙ－ｒｅ—＂?－ｆ?？．?Ｔ＂１?＿７．，?．．?Ｖｍ＊?，ｒ??？ｌ?ｔｉｔ?＊Ｋ?Ｍ＊?Ｗ?■？?｜???ｒｔｏ??？？?Ｍ??Ｃ?／?＾＾＾?＾???ｉ?ｎ?螬夕?ｉ??ｍ????個(gè)??＼?／??Ｉ?Ｉ??｛?｛??圖１．３?ＬＡＭＰ反應(yīng)的原理圖ｌｌｆｌｌ。??Ｆｉｇ．?１．３?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｏｆ?ＬＡＭＰ?ｒｅａｃｔｉｏｎ．??１．２．３解旋酶依賴性擴(kuò)增（ＨＤＡ）??ＨＤＡ是一種基于聚合酶的等溫?cái)U(kuò)增方法，該方法通過(guò)解旋酶來(lái)打開(kāi)ＤＮＡ雙鏈而不??是加熱。ＨＤＡ原理如圖１．４所示，反應(yīng)包括模板分離、弓丨物雜交和延伸三個(gè)步驟。靶標(biāo)??雙鏈ＤＮＡ在解旋酶的作用下，生成用于引物雜交和ＤＮＡ聚合酶延伸的單鏈ＤＮＡ模??板。分離的單鏈ＤＮＡ模板通過(guò)單鏈結(jié)合蛋白（ＳＳＢ）得到穩(wěn)定，引物與單鏈ＤＮＡ模板??結(jié)合后，ＤＮＡ聚合酶在引物的３’末端延伸形成新的雙鏈ＤＮＡ。ＨＤＡ類似于ＰＣＲ，在??


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