豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是近三十年來給全球養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重影響的傳染性疾病之一,主要以妊娠母豬的繁殖障礙及仔豬出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)癥狀為特征。其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）,該病毒具有抗原頻繁變異性、嗜巨噬細胞性、抗體依賴性增強（antibody dependent enhancement,ADE）及持續(xù)感染性等特點,現(xiàn)有的疫苗尚不具備很好的保護力。近年來,國內(nèi)高致病性PRRSV的流行給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,雖然目前已有大量對其致病機制的研究,但隨著抗原變異和相關(guān)受體的不斷發(fā)現(xiàn),該病具體的致病機制依舊留有些許空白。N蛋白是由相對保守的PRRSV ORF7編碼的核衣殼蛋白（nucleocapsid protein）,在保護病毒RNA及病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和病毒粒子的裝配過程中發(fā)揮重要作用。早期研究表明N蛋白是PRRSV感染過程中產(chǎn)生最多的結(jié)構(gòu)蛋白,可以在感染早期誘發(fā)機體產(chǎn)生大量特異性抗體... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

PRRSV的基因組結(jié)構(gòu)和成熟病毒粒子(Sergioetal.2019)

第一章豬繁殖與呼吸綜合征研究進展9Marc-145細胞過程中起著非常重要的作用(Huangetal.2013)。Shanmukappa等人認為PRRSV的3’UTR與CD151存在相互作用，這種與RNA結(jié)合的能力可能有助于促進病毒復(fù)制(Shanmukhappaetal.2007a)。波形蛋白是中間絲(Intermediatefilament，IF)中含量最多的成分，是一種III型IF蛋白，廣泛表達于各種細胞中并與微管和微絲共同組成細胞骨架結(jié)構(gòu)。波形蛋白被認為是PRRSV的細胞受體，但目前相關(guān)報道較少。Kim等人提出波形蛋白與PRRSV核衣殼蛋白結(jié)合時可部分阻斷PRRSV感染Marc-145細胞，而當與抗波形蛋白的單克隆抗體結(jié)合時可徹底阻斷該感染過程(Kimetal.2006)。通過對感染PRRSV的PAMs和Marc-145細胞進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析和Westernblot檢測，發(fā)現(xiàn)波形蛋白在PRRSV感染過程中出現(xiàn)上調(diào)(Zhuangetal.2012)。非肌肉肌球蛋白（non-musclemyosinII，NMⅡ）是由一對230ku的重鏈和兩對輕鏈組成的肌動蛋白的結(jié)合蛋白，它通過自身磷酸化調(diào)節(jié)肌動蛋白的結(jié)合過程。哺乳動物的NMⅡ重鏈有三種同源異構(gòu)體，依次為MYH9（NMHC-IIA）、MYH10（NMHC-IIB）及MYH14（NMHC-IIC）。通過一種識別PRRSVGP5獨特型抗體的單克隆抗獨特型抗體(Mab2-5G2)能夠識別在真核細胞中廣泛表達的MYH9。MYH9的C末端結(jié)構(gòu)域與GP5存在物理相互作用，從而在PRRSV感染過程中發(fā)揮重要作用(Gaoetal.2013b;Zhouetal.2008)�？傊私饧毎荏w間或者受體與其他分子的相互作用對于研發(fā)新的抗病毒疫苗和試劑，以及開發(fā)用于疫苗生產(chǎn)和病毒分離的新細胞系都是非常有價值的。然而，目前人們對于PRRSV的細胞受體還知之甚少，所以關(guān)于這方面的相關(guān)研究仍需要進一步加深。圖1-2PRRSV的主要受體模式圖(Zhangetal.2015)Figure1-2TheprimaryreceptorofPRRSV(Zhangetal.2015)

第二章PRRSV-N蛋白的誘導(dǎo)表達及雙抗夾心ELISA方法的建立23在已確定的最佳反應(yīng)條件下，將重組表達的PRRSV-N蛋白按梯度依次稀釋為0.625g/mL、0.3125g/mL、0.156g/mL作為檢測抗原，并設(shè)立未加蛋白對照組，根據(jù)檢測結(jié)果可繪制相應(yīng)標準曲線。2.2.8PRRSV-N雙抗夾心ELISA方法檢測樣品（1）樣品制備將Marc-145細胞培養(yǎng)至狀態(tài)良好時，胰酶消化計數(shù)，按1105/mL鋪于24孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后加入1MOI的PRRSV-JXA1毒株，分別在感染24h、48h和72h時收集細胞培養(yǎng)上清。將實驗室分離凍存的PAMs復(fù)蘇后，按1106/mL鋪于12孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)12h加入1MOI的PRRSV-JXA1毒株，分別在感染24h、36h和48h時收集細胞培養(yǎng)上清。（2）檢測樣品將收集的細胞培養(yǎng)上清作為待檢測抗原，利用已建立的雙抗夾心ELISA進行檢測，每一時間點收集的樣品必須立即檢測，避免發(fā)生凍融。2.3試驗結(jié)果與分析2.3.1pET28a-N質(zhì)粒的構(gòu)建以PRRSV-SD16的感染性克隆為模板，利用特異性引物擴增出PRRSVORF7基因，擴增片段大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖2-1）。圖2-1pET28a-N重組載體的構(gòu)建（A）PCR擴增結(jié)果基因片段（B）菌液PCR鑒定陽性克隆Figure.2-1ConstructionofpET28a-Nrecombinantvector（A）AmplificationofgenefragmentbyPCR（B）IdentificationofpositiveclonebybacterialfluidPCR將菌液PCR鑒定為陽性的克隆菌擴大培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，利用BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定（圖2-2）。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白磷酸化位點鑒定及其作用研究[J]. 劉歡,姜一峰,黃勤鋒,楊莘,張文超,虞凌雪,高飛,周艷君,童光志.  中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2017(07)
[2]豬CD151轉(zhuǎn)基因PK-15細胞系構(gòu)建及其對豬繁殖與呼吸綜合征病毒的易感性[J]. 黃燕燕,郭睿,張鈺,張鑫宇,夏曉莉,孫懷昌.  微生物學(xué)報. 2013(05)

博士論文
[1]高致病性PRRSV雙抗夾心ELISA抗原檢測試劑盒的研制及基因工程疫苗的研究[D]. 徐鳳琴.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013



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