研究目的研究Elabela對(duì)人臍帶華通膠間充質(zhì)干細(xì)胞（WJ-MSCs）定向心肌樣細(xì)胞分化的影響以及對(duì)APJ表達(dá)量的影響。研究方法復(fù)蘇凍存的人臍帶來(lái)源的WJ-MSCs,當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%以上時(shí),對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將傳代后的細(xì)胞置于細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)孔板上培養(yǎng),待匯合度達(dá)到80%以上時(shí),添加特定濃度的5氮孢苷（5-aza）培養(yǎng)基誘導(dǎo)24h,將誘導(dǎo)分化的細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組更換為含Elabela的10%胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)照組更換為含10%胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于誘導(dǎo)第7,14,21和28d,觀察、記錄細(xì)胞形態(tài)變化以及生長(zhǎng)情況,并收集兩組各階段細(xì)胞總RNA和總蛋白,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)心肌特異性標(biāo)記物Connexin 43、c Tn T、Nkx2.5 m RNA及蛋白表達(dá);培養(yǎng)至28d時(shí),利用細(xì)胞免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)分化后的心肌細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5的表達(dá)情況;同時(shí)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞目的基因APJ表達(dá)量,應(yīng)用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)第28d兩組細(xì)胞APJ的表達(dá)情況。研究結(jié)果在人臍帶WJ-M... 

【文章來(lái)源】：安徽醫(yī)科大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：56 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

倒置顯微鏡下記錄人臍帶WJ-MSCs細(xì)胞形態(tài)（×40）

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文205.2Elabela對(duì)定向心肌樣細(xì)胞分化細(xì)胞形態(tài)的影響第3d可見(jiàn)孔板中細(xì)胞匯合度達(dá)到80%以上，使用5-aza誘導(dǎo)后，向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組加入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基，分別于第7d，第14d，第21d和第28d觀察可見(jiàn)誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞類似心肌細(xì)胞，具有肌管樣結(jié)構(gòu)，相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度快，生長(zhǎng)密度大，細(xì)胞數(shù)量多（見(jiàn)圖2）。但是，在誘導(dǎo)分化第28d左右，兩組均沒(méi)有觀察到自主搏動(dòng)的細(xì)胞。圖2倒置顯微鏡下觀察人臍帶WJ-MSCs分化為心肌樣細(xì)胞形態(tài)（×40）Fig2ObservingthedifferentiationofhumanumbilicalcordWJ-MSCsintocardiomyocyte-likecellsundertheinvertedmicroscope(×40)5.3Westernblot檢測(cè)Elabela對(duì)細(xì)胞各心肌特異性標(biāo)記物蛋白表達(dá)的影響Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，未分化的人臍帶WJ-MSCs不表達(dá)Connexin43，少量表達(dá)cTnT和Nkx2.5。實(shí)驗(yàn)組Connexin43蛋白量的表達(dá)，呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢(shì)，且在第14d的表達(dá)量最高，第21d開(kāi)始出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。在第14d和21d的蛋白表達(dá)量均較對(duì)照組高，分別提高至對(duì)照組142%、140%；實(shí)驗(yàn)組Nkx2.5蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)出一個(gè)波動(dòng)的趨勢(shì)，但在第14d和21d表達(dá)量均高于對(duì)照組，分別提高至對(duì)照組134%和164%；而cTnT蛋白表達(dá)量?jī)H在第21d時(shí)高于對(duì)照組(P<0.05)。（見(jiàn)圖3）

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文21圖3人臍帶WJ-MSCs誘導(dǎo)分化各階段心肌特異性標(biāo)記物的蛋白表達(dá)(“*”表示P<0.05)Fig3ExpressionofmyocardialspecificproteinmarkersduringvariousstagesofthedifferentiationofhumanumbilicalcordWJ-MSCs5.4誘導(dǎo)各階段心肌樣細(xì)胞mRNA檢測(cè)5.4.1誘導(dǎo)各階段心肌樣細(xì)胞提取的RNA電泳檢測(cè)提取誘導(dǎo)分化后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各階段心肌樣細(xì)胞的總RNA，1.5%的TAE瓊脂糖凝膠中進(jìn)行檢測(cè)，從結(jié)果中可以看出，所有樣品的RNA提取結(jié)果均正常，基本沒(méi)有基因組污染。（見(jiàn)圖4）

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療心肌梗死的研究進(jìn)展[J]. 王澤,張寧坤,陳宇.  實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志. 2017(20)
[2]Apelin13對(duì)人胚胎干細(xì)胞定向心肌細(xì)胞分化效率的影響[J]. 程濤,陳宇,張寧坤,高連如,王澤,張燕.  山東醫(yī)藥. 2017(33)
[3]APJ在hESCs定向心肌分化過(guò)程中的表達(dá)特征[J]. 童珊珊,陳宇,張寧坤,高連如,程濤,王澤,雷洪濤,李春花.  安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(12)
[4]臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血性心臟病的新進(jìn)展[J]. 童珊珊,張寧坤,陳宇.  安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2016(02)
[5]Apelin-13對(duì)5-Aza誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響[J]. 徐小紅,王力,張寧坤,鄭楠,高連如,朱智明.  解放軍醫(yī)學(xué)雜志. 2013(10)



本文編號(hào)：3124680