殼斗科植物葉片富含色素、多糖及多酚類等物質(zhì),采用常規(guī)CTAB法、SDS法雖然總DNA產(chǎn)率較高,但多酚類和多糖污染嚴(yán)重;采用進(jìn)口試劑盒提取,雖能有效降低總DNA中多糖多酚類物質(zhì)的污染,但DNA產(chǎn)率低,常伴有明顯降解,不能滿足測序要求,性價比差。因此,現(xiàn)有的DNA提取方法難以滿足二代測序酶切法建庫對DNA純度和產(chǎn)量的要求。通過對4種CTAB提取方法進(jìn)行對比和改良,結(jié)合硅膠吸附法,對6種殼斗科植物葉片總DNA抽提進(jìn)行測試和優(yōu)化,對比不同方法所獲DNA產(chǎn)率、純度差異和對下游分子生物學(xué)實驗的影響。結(jié)果表明,常規(guī)CTAB法和Rezadoost改良法所獲DNA產(chǎn)率高,但多糖污染嚴(yán)重。Sahu改良法所獲DNA純度最高,除糖除酚效果最好,但產(chǎn)率損失最高。而本實驗室的改良CTAB法,在細(xì)胞核裂解之前,加入含有抗壞血酸、Triton X-100等的漂洗液,有效去除多糖多酚等雜質(zhì),所提取的DNA純度高,產(chǎn)率大,相比核裂解之后進(jìn)行除雜的效果更優(yōu),最適于后期分子實驗的應(yīng)用。進(jìn)一步采用硅膠吸附可有效純化并獲得高純度DNA,能滿足下游PCR及酶切實驗。該方法能有效克服傳統(tǒng)CTAB法和試劑盒在殼斗科植物提取中的困難。 

【文章來源】：分子植物育種. 2020,18(20)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

4種方法提取的基因組DNA的電泳圖譜

殼斗科植物葉片含有較多的多糖多酚類次生代謝物(周磊等,2012)，要獲取高質(zhì)量DNA較困難，并且多糖會與DNA共沉淀形成復(fù)合物，在提取時難以去除。本研究通過4種方法分別對硅膠干燥樣與鮮樣進(jìn)行了DNA提取比較，結(jié)果表明4種方法得到的DNA質(zhì)量與產(chǎn)率有所不同，其中常規(guī)CTAB法和Rezadoost改良法得到的DNA產(chǎn)率較大，但其質(zhì)量純度也較差。上述兩種方法都采用粗提DNA后，加入高鹽去除多糖，利用高鹽在乙醇或異丙醇條件下，DNA會優(yōu)先沉淀，從而分離多糖。然而對于多糖含量非常高的材料，多糖會隨DNA共沉淀(Porebski et al.,1997)。在提取過程中，我們觀察到這兩種方法提取的DNA沉淀呈團(tuán)狀，粘稠且難以溶解，甚至在瓊脂糖凝膠電泳時，DNA中雜質(zhì)過高，較粘稠，常飄出點樣孔，或是富集于加樣孔中，因此這些總DNA并不能直接用于后續(xù)的分子實驗。但經(jīng)過硅膠吸附純化后，核酸電泳后的DNA條帶亮而整齊，表明多糖污染是電泳條帶變形的主要原因。圖3 4種方法提取的總DNA進(jìn)行PCR的對比

圖2 硅膠懸濁液吸附純化后的總DNA的電泳檢測本研究改良CTAB法所提取的純度與產(chǎn)量較好，利用多糖多酚等次生代謝物主要存在于細(xì)胞質(zhì)中與DNA相互隔離這一性質(zhì)，在裂解細(xì)胞核之前，利用漂洗液反復(fù)清洗，離心，將細(xì)胞質(zhì)中的大多數(shù)多糖多酚與細(xì)胞核分離開，即可有效去除雜質(zhì)，并且在漂洗液與裂解液中加入抗壞血酸、月桂�；彼徕c等表面活性劑可降低醌類物質(zhì)的影響，有效防止多酚類物質(zhì)被氧化。漂洗液中加入的Triton X-100表面去污劑，有助于蛋白質(zhì)與DNA的分離，并且能有效去除色素污染，從而獲取較高質(zhì)量的基因組DNA。由于多糖會隨DNA共沉淀，因此本方法比起普通的CTAB法在裂解DNA后再除雜的效果更加顯著。而Sahu改良法主要通過在細(xì)胞提取液中加入蔗糖，60℃水浴，調(diào)節(jié)提取液的滲透壓，使細(xì)胞核內(nèi)滲透壓保持平衡，結(jié)合一定的轉(zhuǎn)速離心，從而分離不同密度的內(nèi)容物，以此獲得高質(zhì)量的DNA。雖然這種方法所得到的DNA產(chǎn)量有較大的損失，但也可直接用于后續(xù)的分子實驗，避免了因純化帶來產(chǎn)量的再次損失。而對產(chǎn)量要求較高的分子實驗，也可通過此方法提取多管DNA，然后以合并的方法解決。結(jié)合4種方法提取的DNA的產(chǎn)率和純度來看，改良CTAB法比其他方法更具優(yōu)勢，更適于直接用于后續(xù)的分子實驗。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]殼斗科植物的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展[J]. 周磊,許敏,楊崇仁,張穎君.  天然產(chǎn)物研究與開發(fā). 2012(02)
[2]大青楊基因組DNA提取方法的比較[J]. 許雷,劉一星,方連玉.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2009(06)
[3]DNA提取方法對一串紅不同部位DNA提取的比較[J]. 侯艷霞,湯浩茹,張勇,羅婭,董曉莉.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2009(01)
[4]櫟屬植物DNA提取方法的研究[J]. 王玲玲,葉青雷,王學(xué)英,石生林,李群,尹迎禮.  沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報. 2008(06)
[5]米心水青岡基因組DNA提取及RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化[J]. 周則剛,方炎明,王標(biāo).  植物研究. 2008(06)
[6]改良CTAB法用于多年生植物組織基因組DNA的大量提取[J]. 陳昆松,李方,徐昌杰,張上隆,傅承新.  遺傳. 2004(04)
[7]從富含酚類的茶類植物葉中提取純凈的總DNA[J]. 袁長春,施蘇華,葉創(chuàng)興.  中山大學(xué)學(xué)報論叢. 2001(03)
[8]中國殼斗科的地理分布及其與氣候條件的關(guān)系[J]. 劉茂松,洪必恭.  植物生態(tài)學(xué)報. 1998(01)



本文編號：3117229