畢赤酵母基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展
發(fā)布時(shí)間：2021-04-01 20:24
巴斯德畢赤酵母是一種重要的蛋白表達(dá)系統(tǒng),基因編輯技術(shù)作為代謝工程的基本工具,對(duì)于畢赤酵母的代謝改造十分重要。近十年基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速,除傳統(tǒng)的同源重組和Cre/loxP重組外,相繼出現(xiàn)了許多新的基因編輯技術(shù),例如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等,這些技術(shù)的出現(xiàn)使基因編輯更加簡(jiǎn)便高效。本文對(duì)畢赤酵母中傳統(tǒng)和新型基因編輯技術(shù)的原理應(yīng)用和研究進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述,并結(jié)合相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展對(duì)畢赤酵母基因編輯技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了展望。
【文章來(lái)源】：微生物學(xué)通報(bào). 2020,47(02)北大核心CSCD
【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)
【部分圖文】：
RNA polⅡ啟動(dòng)子和RNA polⅢ啟動(dòng)子表達(dá)的gRNA結(jié)構(gòu)差別[30]
Cre/loxP系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一種基因修飾技術(shù)，源于P1噬菌體[16]。Cre是一種位點(diǎn)特異性重組酶，是由343個(gè)氨基酸組成的一種雙結(jié)構(gòu)域蛋白，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別是N-端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)和C-端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD)。Cre重組酶能夠特異性識(shí)別loxP位點(diǎn)，對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)間的基因進(jìn)行重組[17]。loxP位點(diǎn)由兩個(gè)13 bp的反向重復(fù)序列和8 bp的間隔序列組成，間隔序列位于兩個(gè)反向重復(fù)序列中間，決定了loxP位點(diǎn)的方向。兩邊的兩個(gè)反向重復(fù)序列分別和間隔序列1、8位上的堿基組成兩個(gè)14 bp的重組酶結(jié)合元件(recombinase-binding element,RBE)，一個(gè)RBE的突變對(duì)酶和位點(diǎn)的結(jié)合影響不大，但當(dāng)兩個(gè)RBE都發(fā)生突變時(shí)，Cre重組酶與loxP位點(diǎn)的結(jié)合效率將會(huì)大大下降[14]。當(dāng)Cre重組酶的NTD識(shí)別到loxP位點(diǎn)時(shí)，便會(huì)結(jié)合到loxP位點(diǎn)的一個(gè)RBE上，而后兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)NA雙鏈包圍，形成一個(gè)如圖2A所示的“C”型的夾子。兩個(gè)loxP位點(diǎn)一共結(jié)合4個(gè)Cre重組酶，4個(gè)Cre酶會(huì)組成一個(gè)四聚體，由結(jié)構(gòu)域CTD對(duì)DNA序列進(jìn)行切割，切割位點(diǎn)分別位于兩個(gè)間隔序列的1/2位和7/8之間[17-18]，如圖2B所示。Cre酶介導(dǎo)兩個(gè)位點(diǎn)間基因的重組方式取決于兩個(gè)loxP位點(diǎn)的方向，根據(jù)不同的情況，一共分為3種重組方式：(1)當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)在同一條DNA鏈上，且方向相同時(shí)，Cre重組酶可以對(duì)2個(gè)位點(diǎn)間的序列進(jìn)行切除；(2)當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)在同一條鏈上，且方向相反時(shí)，Cre重組酶能夠?qū)蓚�(gè)位點(diǎn)間的基因方向調(diào)換；(3)當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)位于不同的兩條鏈上時(shí)，Cre重組酶能夠介導(dǎo)兩條鏈之間的基因交換。目前在畢赤酵母中使用較多的是基因敲除功能，倒位和易位的功能使用較少。
引導(dǎo)Cas9的RNA由兩部分組成，一部分是靶向目標(biāo)系列的crRNA(CRISPR targeting RNA)，該部分是由前體RNA(pre-crRNA)加工而來(lái)的一段含有保守重復(fù)序列和間隔序列的RNA，可以通過(guò)修改間隔序列靶向不同的DNA序列。另一部分是與重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA,tracrRNA(trans-activating crRNA)。這兩部RNA相互結(jié)合后與Cas9形成一個(gè)復(fù)合體，將Cas9引導(dǎo)到靶標(biāo)序列，在crRNA互補(bǔ)序列下游臨近PAM位點(diǎn)區(qū)對(duì)DNA進(jìn)行剪切，產(chǎn)生DSB，從而激發(fā)HR或NHEJ。為方便使用，Jinek等將兩部分進(jìn)行簡(jiǎn)化，形成了由一個(gè)結(jié)構(gòu)RNA和20 bp靶向目標(biāo)基因的可變RNA組成的single-guide RNA(gRNA或sgRNA)[28]，從而使該系統(tǒng)使用更簡(jiǎn)便。CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然操作簡(jiǎn)便，但是Cas9蛋白序列和gRNA序列的選擇和表達(dá)等多種因素都會(huì)影響編輯效率。對(duì)于不同的物種，我們需要選擇不同的條件來(lái)達(dá)到較高的效率。Cas的表達(dá)主要涉及到啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，序列密碼子的優(yōu)化。在釀酒酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)Cas9會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成負(fù)面影響，但選擇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子又會(huì)因表達(dá)時(shí)間不夠，導(dǎo)致編輯效率下降至20%以下，而選用組成型的弱啟動(dòng)子不僅不會(huì)影響菌株生長(zhǎng)還能保證較高的編輯效率[29]。除啟動(dòng)子外，Cas9蛋白序列的選擇也是影響編輯效率的重要因素，目前使用較為廣泛的Cas9蛋白是來(lái)自于化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9[27,29]，但Weninger等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，SpCas9和PpCas9(由SpCas9經(jīng)過(guò)畢赤酵母表達(dá)密碼子優(yōu)化得到)在畢赤酵母中的編輯效率都很低，而經(jīng)過(guò)人源密碼子優(yōu)化的HsCas9在畢赤酵母中能發(fā)揮較好的作用[30]。
本文編號(hào)：3113917
【文章來(lái)源】：微生物學(xué)通報(bào). 2020,47(02)北大核心CSCD
【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)
【部分圖文】：
RNA polⅡ啟動(dòng)子和RNA polⅢ啟動(dòng)子表達(dá)的gRNA結(jié)構(gòu)差別[30]
Cre/loxP系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的一種基因修飾技術(shù)，源于P1噬菌體[16]。Cre是一種位點(diǎn)特異性重組酶，是由343個(gè)氨基酸組成的一種雙結(jié)構(gòu)域蛋白，兩個(gè)結(jié)構(gòu)域分別是N-端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)和C-端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD)。Cre重組酶能夠特異性識(shí)別loxP位點(diǎn)，對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)間的基因進(jìn)行重組[17]。loxP位點(diǎn)由兩個(gè)13 bp的反向重復(fù)序列和8 bp的間隔序列組成，間隔序列位于兩個(gè)反向重復(fù)序列中間，決定了loxP位點(diǎn)的方向。兩邊的兩個(gè)反向重復(fù)序列分別和間隔序列1、8位上的堿基組成兩個(gè)14 bp的重組酶結(jié)合元件(recombinase-binding element,RBE)，一個(gè)RBE的突變對(duì)酶和位點(diǎn)的結(jié)合影響不大，但當(dāng)兩個(gè)RBE都發(fā)生突變時(shí)，Cre重組酶與loxP位點(diǎn)的結(jié)合效率將會(huì)大大下降[14]。當(dāng)Cre重組酶的NTD識(shí)別到loxP位點(diǎn)時(shí)，便會(huì)結(jié)合到loxP位點(diǎn)的一個(gè)RBE上，而后兩個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)NA雙鏈包圍，形成一個(gè)如圖2A所示的“C”型的夾子。兩個(gè)loxP位點(diǎn)一共結(jié)合4個(gè)Cre重組酶，4個(gè)Cre酶會(huì)組成一個(gè)四聚體，由結(jié)構(gòu)域CTD對(duì)DNA序列進(jìn)行切割，切割位點(diǎn)分別位于兩個(gè)間隔序列的1/2位和7/8之間[17-18]，如圖2B所示。Cre酶介導(dǎo)兩個(gè)位點(diǎn)間基因的重組方式取決于兩個(gè)loxP位點(diǎn)的方向，根據(jù)不同的情況，一共分為3種重組方式：(1)當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)在同一條DNA鏈上，且方向相同時(shí)，Cre重組酶可以對(duì)2個(gè)位點(diǎn)間的序列進(jìn)行切除；(2)當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)在同一條鏈上，且方向相反時(shí)，Cre重組酶能夠?qū)蓚�(gè)位點(diǎn)間的基因方向調(diào)換；(3)當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)位于不同的兩條鏈上時(shí)，Cre重組酶能夠介導(dǎo)兩條鏈之間的基因交換。目前在畢赤酵母中使用較多的是基因敲除功能，倒位和易位的功能使用較少。
引導(dǎo)Cas9的RNA由兩部分組成，一部分是靶向目標(biāo)系列的crRNA(CRISPR targeting RNA)，該部分是由前體RNA(pre-crRNA)加工而來(lái)的一段含有保守重復(fù)序列和間隔序列的RNA，可以通過(guò)修改間隔序列靶向不同的DNA序列。另一部分是與重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA,tracrRNA(trans-activating crRNA)。這兩部RNA相互結(jié)合后與Cas9形成一個(gè)復(fù)合體，將Cas9引導(dǎo)到靶標(biāo)序列，在crRNA互補(bǔ)序列下游臨近PAM位點(diǎn)區(qū)對(duì)DNA進(jìn)行剪切，產(chǎn)生DSB，從而激發(fā)HR或NHEJ。為方便使用，Jinek等將兩部分進(jìn)行簡(jiǎn)化，形成了由一個(gè)結(jié)構(gòu)RNA和20 bp靶向目標(biāo)基因的可變RNA組成的single-guide RNA(gRNA或sgRNA)[28]，從而使該系統(tǒng)使用更簡(jiǎn)便。CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然操作簡(jiǎn)便，但是Cas9蛋白序列和gRNA序列的選擇和表達(dá)等多種因素都會(huì)影響編輯效率。對(duì)于不同的物種，我們需要選擇不同的條件來(lái)達(dá)到較高的效率。Cas的表達(dá)主要涉及到啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，序列密碼子的優(yōu)化。在釀酒酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，使用強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)Cas9會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)造成負(fù)面影響，但選擇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子又會(huì)因表達(dá)時(shí)間不夠，導(dǎo)致編輯效率下降至20%以下，而選用組成型的弱啟動(dòng)子不僅不會(huì)影響菌株生長(zhǎng)還能保證較高的編輯效率[29]。除啟動(dòng)子外，Cas9蛋白序列的選擇也是影響編輯效率的重要因素，目前使用較為廣泛的Cas9蛋白是來(lái)自于化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9[27,29]，但Weninger等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，SpCas9和PpCas9(由SpCas9經(jīng)過(guò)畢赤酵母表達(dá)密碼子優(yōu)化得到)在畢赤酵母中的編輯效率都很低，而經(jīng)過(guò)人源密碼子優(yōu)化的HsCas9在畢赤酵母中能發(fā)揮較好的作用[30]。
本文編號(hào)：3113917
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