畢赤酵母基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展
發(fā)布時間：2021-04-01 20:24
巴斯德畢赤酵母是一種重要的蛋白表達(dá)系統(tǒng),基因編輯技術(shù)作為代謝工程的基本工具,對于畢赤酵母的代謝改造十分重要。近十年基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速,除傳統(tǒng)的同源重組和Cre/loxP重組外,相繼出現(xiàn)了許多新的基因編輯技術(shù),例如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等,這些技術(shù)的出現(xiàn)使基因編輯更加簡便高效。本文對畢赤酵母中傳統(tǒng)和新型基因編輯技術(shù)的原理應(yīng)用和研究進(jìn)展進(jìn)行了簡要綜述,并結(jié)合相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展對畢赤酵母基因編輯技術(shù)的發(fā)展進(jìn)行了展望。
【文章來源】：微生物學(xué)通報. 2020,47(02)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：9 頁
【部分圖文】：
RNA polⅡ啟動子和RNA polⅢ啟動子表達(dá)的gRNA結(jié)構(gòu)差別[30]
Cre/loxP系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種基因修飾技術(shù)，源于P1噬菌體[16]。Cre是一種位點(diǎn)特異性重組酶，是由343個氨基酸組成的一種雙結(jié)構(gòu)域蛋白，兩個結(jié)構(gòu)域分別是N-端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)和C-端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD)。Cre重組酶能夠特異性識別loxP位點(diǎn)，對兩個位點(diǎn)間的基因進(jìn)行重組[17]。loxP位點(diǎn)由兩個13 bp的反向重復(fù)序列和8 bp的間隔序列組成，間隔序列位于兩個反向重復(fù)序列中間，決定了loxP位點(diǎn)的方向。兩邊的兩個反向重復(fù)序列分別和間隔序列1、8位上的堿基組成兩個14 bp的重組酶結(jié)合元件(recombinase-binding element,RBE)，一個RBE的突變對酶和位點(diǎn)的結(jié)合影響不大，但當(dāng)兩個RBE都發(fā)生突變時，Cre重組酶與loxP位點(diǎn)的結(jié)合效率將會大大下降[14]。當(dāng)Cre重組酶的NTD識別到loxP位點(diǎn)時，便會結(jié)合到loxP位點(diǎn)的一個RBE上，而后兩個結(jié)構(gòu)域?qū)NA雙鏈包圍，形成一個如圖2A所示的“C”型的夾子。兩個loxP位點(diǎn)一共結(jié)合4個Cre重組酶，4個Cre酶會組成一個四聚體，由結(jié)構(gòu)域CTD對DNA序列進(jìn)行切割，切割位點(diǎn)分別位于兩個間隔序列的1/2位和7/8之間[17-18]，如圖2B所示。Cre酶介導(dǎo)兩個位點(diǎn)間基因的重組方式取決于兩個loxP位點(diǎn)的方向，根據(jù)不同的情況，一共分為3種重組方式：(1)當(dāng)兩個位點(diǎn)在同一條DNA鏈上，且方向相同時，Cre重組酶可以對2個位點(diǎn)間的序列進(jìn)行切除；(2)當(dāng)兩個位點(diǎn)在同一條鏈上，且方向相反時，Cre重組酶能夠?qū)蓚�位點(diǎn)間的基因方向調(diào)換；(3)當(dāng)兩個位點(diǎn)位于不同的兩條鏈上時，Cre重組酶能夠介導(dǎo)兩條鏈之間的基因交換。目前在畢赤酵母中使用較多的是基因敲除功能，倒位和易位的功能使用較少。
引導(dǎo)Cas9的RNA由兩部分組成，一部分是靶向目標(biāo)系列的crRNA(CRISPR targeting RNA)，該部分是由前體RNA(pre-crRNA)加工而來的一段含有保守重復(fù)序列和間隔序列的RNA，可以通過修改間隔序列靶向不同的DNA序列。另一部分是與重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA,tracrRNA(trans-activating crRNA)。這兩部RNA相互結(jié)合后與Cas9形成一個復(fù)合體，將Cas9引導(dǎo)到靶標(biāo)序列，在crRNA互補(bǔ)序列下游臨近PAM位點(diǎn)區(qū)對DNA進(jìn)行剪切，產(chǎn)生DSB，從而激發(fā)HR或NHEJ。為方便使用，Jinek等將兩部分進(jìn)行簡化，形成了由一個結(jié)構(gòu)RNA和20 bp靶向目標(biāo)基因的可變RNA組成的single-guide RNA(gRNA或sgRNA)[28]，從而使該系統(tǒng)使用更簡便。CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然操作簡便，但是Cas9蛋白序列和gRNA序列的選擇和表達(dá)等多種因素都會影響編輯效率。對于不同的物種，我們需要選擇不同的條件來達(dá)到較高的效率。Cas的表達(dá)主要涉及到啟動子的強(qiáng)弱，序列密碼子的優(yōu)化。在釀酒酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，使用強(qiáng)啟動子表達(dá)Cas9會對菌株的生長造成負(fù)面影響，但選擇誘導(dǎo)型啟動子又會因表達(dá)時間不夠，導(dǎo)致編輯效率下降至20%以下，而選用組成型的弱啟動子不僅不會影響菌株生長還能保證較高的編輯效率[29]。除啟動子外，Cas9蛋白序列的選擇也是影響編輯效率的重要因素，目前使用較為廣泛的Cas9蛋白是來自于化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9[27,29]，但Weninger等通過研究發(fā)現(xiàn)，SpCas9和PpCas9(由SpCas9經(jīng)過畢赤酵母表達(dá)密碼子優(yōu)化得到)在畢赤酵母中的編輯效率都很低，而經(jīng)過人源密碼子優(yōu)化的HsCas9在畢赤酵母中能發(fā)揮較好的作用[30]。
本文編號：3113917
【文章來源】：微生物學(xué)通報. 2020,47(02)北大核心CSCD
【文章頁數(shù)】：9 頁
【部分圖文】：
RNA polⅡ啟動子和RNA polⅢ啟動子表達(dá)的gRNA結(jié)構(gòu)差別[30]
Cre/loxP系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種基因修飾技術(shù)，源于P1噬菌體[16]。Cre是一種位點(diǎn)特異性重組酶，是由343個氨基酸組成的一種雙結(jié)構(gòu)域蛋白，兩個結(jié)構(gòu)域分別是N-端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain,NTD)和C-端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain,CTD)。Cre重組酶能夠特異性識別loxP位點(diǎn)，對兩個位點(diǎn)間的基因進(jìn)行重組[17]。loxP位點(diǎn)由兩個13 bp的反向重復(fù)序列和8 bp的間隔序列組成，間隔序列位于兩個反向重復(fù)序列中間，決定了loxP位點(diǎn)的方向。兩邊的兩個反向重復(fù)序列分別和間隔序列1、8位上的堿基組成兩個14 bp的重組酶結(jié)合元件(recombinase-binding element,RBE)，一個RBE的突變對酶和位點(diǎn)的結(jié)合影響不大，但當(dāng)兩個RBE都發(fā)生突變時，Cre重組酶與loxP位點(diǎn)的結(jié)合效率將會大大下降[14]。當(dāng)Cre重組酶的NTD識別到loxP位點(diǎn)時，便會結(jié)合到loxP位點(diǎn)的一個RBE上，而后兩個結(jié)構(gòu)域?qū)NA雙鏈包圍，形成一個如圖2A所示的“C”型的夾子。兩個loxP位點(diǎn)一共結(jié)合4個Cre重組酶，4個Cre酶會組成一個四聚體，由結(jié)構(gòu)域CTD對DNA序列進(jìn)行切割，切割位點(diǎn)分別位于兩個間隔序列的1/2位和7/8之間[17-18]，如圖2B所示。Cre酶介導(dǎo)兩個位點(diǎn)間基因的重組方式取決于兩個loxP位點(diǎn)的方向，根據(jù)不同的情況，一共分為3種重組方式：(1)當(dāng)兩個位點(diǎn)在同一條DNA鏈上，且方向相同時，Cre重組酶可以對2個位點(diǎn)間的序列進(jìn)行切除；(2)當(dāng)兩個位點(diǎn)在同一條鏈上，且方向相反時，Cre重組酶能夠?qū)蓚�位點(diǎn)間的基因方向調(diào)換；(3)當(dāng)兩個位點(diǎn)位于不同的兩條鏈上時，Cre重組酶能夠介導(dǎo)兩條鏈之間的基因交換。目前在畢赤酵母中使用較多的是基因敲除功能，倒位和易位的功能使用較少。
引導(dǎo)Cas9的RNA由兩部分組成，一部分是靶向目標(biāo)系列的crRNA(CRISPR targeting RNA)，該部分是由前體RNA(pre-crRNA)加工而來的一段含有保守重復(fù)序列和間隔序列的RNA，可以通過修改間隔序列靶向不同的DNA序列。另一部分是與重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crRNA,tracrRNA(trans-activating crRNA)。這兩部RNA相互結(jié)合后與Cas9形成一個復(fù)合體，將Cas9引導(dǎo)到靶標(biāo)序列，在crRNA互補(bǔ)序列下游臨近PAM位點(diǎn)區(qū)對DNA進(jìn)行剪切，產(chǎn)生DSB，從而激發(fā)HR或NHEJ。為方便使用，Jinek等將兩部分進(jìn)行簡化，形成了由一個結(jié)構(gòu)RNA和20 bp靶向目標(biāo)基因的可變RNA組成的single-guide RNA(gRNA或sgRNA)[28]，從而使該系統(tǒng)使用更簡便。CRISPR/Cas9系統(tǒng)雖然操作簡便，但是Cas9蛋白序列和gRNA序列的選擇和表達(dá)等多種因素都會影響編輯效率。對于不同的物種，我們需要選擇不同的條件來達(dá)到較高的效率。Cas的表達(dá)主要涉及到啟動子的強(qiáng)弱，序列密碼子的優(yōu)化。在釀酒酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，使用強(qiáng)啟動子表達(dá)Cas9會對菌株的生長造成負(fù)面影響，但選擇誘導(dǎo)型啟動子又會因表達(dá)時間不夠，導(dǎo)致編輯效率下降至20%以下，而選用組成型的弱啟動子不僅不會影響菌株生長還能保證較高的編輯效率[29]。除啟動子外，Cas9蛋白序列的選擇也是影響編輯效率的重要因素，目前使用較為廣泛的Cas9蛋白是來自于化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的SpCas9[27,29]，但Weninger等通過研究發(fā)現(xiàn)，SpCas9和PpCas9(由SpCas9經(jīng)過畢赤酵母表達(dá)密碼子優(yōu)化得到)在畢赤酵母中的編輯效率都很低，而經(jīng)過人源密碼子優(yōu)化的HsCas9在畢赤酵母中能發(fā)揮較好的作用[30]。
本文編號：3113917
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