非編碼RNA在細胞中起到非常重要的調(diào)控作用。組成型衰變元件（CDE）是一段高度保守的含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA序列,存在于脊椎動物mRNA的3’末端非編碼區(qū),而這些mRNA大多數(shù)編碼與細胞發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄、炎癥和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的蛋白質(zhì),比如腫瘤壞死因子α,誘導型T細胞共刺激因子等。篩選發(fā)現(xiàn)CTLA4 RNA是一段長為15 nt的非編碼RNA分子,其序列與已報道的CDE序列高度相似,而它的高級結(jié)構(gòu)未知。有研究報道Roquin和它的同源物Roquin-2通過結(jié)合細胞內(nèi)mRNA的CDE序列,促進mRNA的降解,進而維持RNA在細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)和預防自身免疫性疾病。人源Roquin-2蛋白是一類泛素連接酶（E3）,它的N端主要包含ROQ和HEPN等結(jié)構(gòu)域,其中ROQ結(jié)構(gòu)域負責與RNA的結(jié)合。Roquin-2通過結(jié)合CDE而調(diào)控mRNA的作用機制是否存在普適的規(guī)律目前還不清楚。在本研究中,我們在體外分別純化了CTLA4 RNA和人源Roquin-2蛋白的兩個片段（171-325,87-404）,通過EMSA實驗確定了CTLA4 RNA和Roquin-2的相互作用。采用X射線晶體學的方法,解析了2.15?CTL... 

【文章來源】：浙江大學浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

TNF-的CDE序列比對結(jié)果

浙江大學碩士學位論文緒論4利用In-lineProbing分別預測小鼠和人類的TNF-α的CDE37序列的二級結(jié)構(gòu)模型(圖1.2)，發(fā)現(xiàn)其核心序列形成一個含有六個堿基對的stem結(jié)構(gòu)，命名為P2，P2末端形成一個含有三個堿基的loop，命名為L2。進一步的點突變實驗發(fā)現(xiàn)，破壞P2的堿基配對(圖1.2)會抑制CDE降解mRNA的功能活性(Leppeketal.,2013)。1.2Roquin1.2.1背景利用RNA適配體(Aptamer)進行親和層析實驗，將適配體4xS1m的基因序列連接在CDE37基因序列之后并一起轉(zhuǎn)錄成RNA，利用4xS1m對鏈霉親和素的高結(jié)合性將CDE37固定在層析柱子上，用CDE37去富集細胞裂解液中的蛋白分子，結(jié)合質(zhì)譜分析，篩選發(fā)現(xiàn)了Roquin蛋白，包括Roquin-1和它的同源物Roquin-2，可以被CDE37-4xS1m強富集(Leppeketal.,2013)。最早發(fā)現(xiàn)Roquin基因是在2005年，對小鼠的基因組系統(tǒng)篩選與自身免疫相關(guān)的調(diào)節(jié)因子，分離出一個患有嚴重自身免疫性疾病的小鼠品系sanroque，該圖1.2CDE37的二級結(jié)構(gòu)模型

浙江大學碩士學位論文緒論5品系會破壞誘導型T細胞共刺激因子——卵泡T細胞的一種必需共刺激受體——的阻遏因子，而致病突變就位于Roquin序列中(Vinuesaetal.,2005)。Roquin被認為是一類泛素連接酶(E3)，因為其N端有一個RING-1型結(jié)構(gòu)，而泛素連接酶(E3)家族蛋白都有RING結(jié)構(gòu)域，而且RING結(jié)構(gòu)域與泛素結(jié)合酶(E2)有直接的相互作用(Joazeiro&Weissman,2000;Vinuesaetal.,2005)。1.2.2Roquin-2的結(jié)構(gòu)人源Roquin-2的N端包含一個RING結(jié)構(gòu)域、一個ROQ結(jié)構(gòu)域、兩個HEPN結(jié)構(gòu)域以及一個CCCH型的鋅指結(jié)構(gòu)，其中，ROQ結(jié)構(gòu)域負責結(jié)合mRNA的CDE序列(Tan,Zhou,Kiledjian,&Tong,2014)，而其C端則有一段富含脯氨酸的序列和一段Coiled-coil結(jié)構(gòu)(ShunyaSakurai,UmeharuOhto,&ToshiyukiShimizu,2015)。其中ROQ結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)如圖1.3所示，主要包含7個α-helix結(jié)構(gòu)和2個β-sheet結(jié)構(gòu)(PDB：4ZLC)(ShunyaSakuraietal.,2015)。1.2.2Roquin和RNA的結(jié)合規(guī)律Roquin通過識別靶mRNA的CDE序列，參與mRNA的降解，在預防自身免疫性疾病和維持RNA在細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)上起著至關(guān)重要的作用。一方面，Roquin圖1.3Roquin-2的ROQ三級結(jié)構(gòu)


本文編號：3112540