GALT基因突變是人類I型半乳糖血癥的主要病因。擬通過CRISPR/cas9系統(tǒng)打靶小鼠Galt基因以模擬人GALT基因突變,從而為建立精準模擬I型半乳糖血癥的動物模型奠定基礎(chǔ)。首先分析了我國I型半乳糖血癥GALT基因的致病突變位點,并將其定位在小鼠Glat基因上,作為小鼠Galt基因的擬突變位點,然后根據(jù)擬突變位點區(qū)域的序列設(shè)計了sgRNA導(dǎo)向序列,構(gòu)建sgRNA表達質(zhì)粒,將其與cas9表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染小鼠3T3細胞,通過嘌呤霉素和殺稻瘟菌素篩選陽性轉(zhuǎn)染細胞,提取陽性細胞基因組DNA,PCR擴增打靶位點的DNA片段,通過TA克隆測序鑒定基因編輯情況并分析編輯效率。結(jié)果表明,3個sgRNA導(dǎo)向序列均可以通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)高效編輯小鼠Galt基因,編輯效率為100%。 

【文章來源】：生物技術(shù)通報. 2020,36(08)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

模擬人GALT基因突變的小鼠Galt基因打靶位點示意圖及其序列

本研究設(shè)計的sgRNA在Galt基因上的靶序列符合5"-N(21)GG的序列排列規(guī)則，且在Galt基因上的靶序列是唯一的。篩選出的3條sgRNA的核苷酸序列分別為：sgRNA1:5"-agccttaccatgccagccca-3";sgRNA2:5"-ctccatgggctggcatggta-3";sgRNA3:5"-ggctggcatggtaaggcttt-3"。按本研究實驗方法構(gòu)建的pGL3-U6-Galt-sgRNA質(zhì)粒電泳圖（圖2),3種質(zhì)粒大小符合預(yù)期。質(zhì)粒的測序峰圖（圖3），陰影部分代表質(zhì)粒中sgRNA編碼序列，與設(shè)計的3條sgRNA相符，表明sgRNA表達載體初步構(gòu)建成功。圖3 sgRNA表達質(zhì)粒測序峰圖

sgRNA表達質(zhì)粒測序峰圖

【參考文獻】：
期刊論文
[1]新生兒半乳糖血癥篩查及基因譜分析[J]. 楊茹萊,童凡,洪芳,錢古柃,吳鼎文,趙正言.  中華兒科雜志. 2017 (02)



本文編號：3108349